肿瘤植入后第5天将小鼠随机分为不同的治疗组。在第5、6、9、9天给予抗小鼠抗程序性细胞死亡抗体或同种型对照抗体治疗。通过腹膜内注射在肿瘤植入后的12、15。每天通过管饲法给予索拉非尼。治疗21天后测量肿瘤重量。在治疗结束时，收集血液样本以测量血栓图和生化，并收集福尔马林固定，石蜡包埋的肿瘤样本以分析肿瘤细胞凋亡，微血管密度和肿瘤增殖。为了评估CD8T细胞在抗抗程序性细胞死亡抗体和索拉非尼的抗肿瘤作用中的作用，通过腹膜内注射抗CD8抗体或同种型对照抗体来消除CD8T细胞。抗体植入的剂量在肿瘤植入后第5天为0.5毫克，然后在第3、5、7、9、12和15天为0.25毫克。如前所述，通过流式细胞术确认了CD8细胞的耗竭。
实验结果表示为平均值±标准差，单因素方差分析用于评估研究组之间差异的统计学显着性。通过特殊方法计算动物存活率，并通过对数秩检验进行比较。如前所述进行了基因集富集分析。使用信噪比度量标准对条件之间的基因表达差异和基于表型的排列进行1000次评分，以获得p值。
程序性死亡配体抗体在人和鼠肝细胞癌细胞系中的表达通过蛋白质印迹法进行了检查，由于内源性程序性死亡配体抗体的表达较低，因此选择了某细胞系进行进一步的实验。出国看病服务机构共聚焦免疫荧光显微镜和流式细胞术证实了用程序性死亡配体抗体质粒转染的稳定克隆中程序性死亡配体抗体的表达。选择亚克隆4用于进一步的实验。
使用免疫组比较了亲本和表达程序性死亡配体抗体的小鼠肝肿瘤中免疫相关基因的表达，以进一步评估程序性死亡配体抗体表达对肝肿瘤微环境的影响。
首先使用抗抗程序性细胞死亡治疗开始5天后收集的原位肝肿瘤样本，通过流式细胞术分析抗抗程序性细胞死亡治疗后的肿瘤浸润免疫细胞的模式。在表达程序性死亡配体抗体的肿瘤中发现了抗抗程序性细胞死亡治疗后CD8T细胞增加的趋势。在肿瘤细胞中程序性死亡配体抗体表达增加CD4T细胞的数量，但抗-程序性死亡配体疗法的效果不明显。进一步的分析表明，表达抗程序性细胞死亡的CD8和CD4T细胞百分比在抗抗程序性细胞死亡治疗后显着降低。自然杀伤细胞，巨噬细胞，和树突状细胞的数量分别为低和肿瘤程序性死亡配体抗体表达或抗-程序性死亡配体治疗不影响细胞数显著。
然后使用抗抗程序性细胞死亡治疗开始21天后收集的原位肝肿瘤样本进行免疫组织化学研究。表达程序性死亡配体抗体的肿瘤可能比亲本肿瘤募集更多的CD8T细胞。抗抗程序性细胞死亡治疗后，表达程序性死亡配体抗体的CD8和CD4T细胞数量均比亲本肿瘤更明显。肿瘤程序性死亡配体抗体表达或抗抗程序性细胞死亡治疗不会显着影响自然杀伤细胞，巨噬细胞和树突状细胞的数量。在流式细胞术和免疫组织化学实验之间，T细胞变化模式的不一致发现可能部分是由于肿瘤采样所选择的不同时间点造成的。抗抗程序性细胞死亡处理可显着增加肿瘤细胞的凋亡并降低肿瘤细胞的增殖，这两者在表达程序性死亡配体抗体的肿瘤中均更为明显，但在表达程序性死亡配体抗体的小鼠或亲本的小鼠之间，肿瘤微血管密度降低的程度相似肿瘤。结果表明，程序性死亡配体抗体的表达可能会影响抗抗程序性细胞死亡肝癌治疗的疗效以及激活肿瘤微环境中T细胞的能力。
小鼠轴承程序性死亡配体抗体表达肝肿瘤显示显著更好的生存时间抗-程序性死亡配体处理后，而小鼠轴承亲本肿瘤显示出那些具有抗-程序性死亡配体或媒介物中。当将抗抗程序性细胞死亡与索拉非尼联合使用时，携带亲本或表达程序性死亡配体抗体的肿瘤小鼠的肿瘤消退程度和存活率都有改善。用组合方案治疗的小鼠在体重，血常规和血液化学数据方面显示出相似的安全性。数据表明，与索拉非尼合用可克服由肝细胞癌中程序性死亡配体抗体表达引起的耐药性。通过使用抗CD8抗体的耗竭实验进一步证实了CD8T细胞在抗肿瘤活性中的作用。通过流式细胞术证明了耗尽CD8T细胞的功效。抗-程序性死亡配体治疗，单独使用或与索拉非尼组合的抗肿瘤效力，被CD8T细胞已经耗尽。 |
