黑色素瘤的细胞免疫治疗

　　在不存在对肿瘤细胞系的全转录组数据，七个黑色素瘤细胞系GSE46817公开可用RNA-SEQ型材的突变基因的粗略估计表达，平均每百万每千碱基读取映射读取表达值。认为平均RPKM大于1且标准差低的基因已表达。
　　 为了验证所选基因和突变或野生型等位基因的转录，使用试剂盒分离了患者和患者肿瘤细胞系的总RNA，并在生物分析仪上测量了质量和数量。为了确认突变的等位基因的表达，将分离的RNA用DNase进行处理，并使用逆转录酶引物转化为cDNA。对于每个样品，包括没有逆转录酶的对照以检测可能的污染基因组DNA。使用DNA聚合酶。将PCR产物送至Sanger测序，并从所得电泳图中评估等位基因表达。
　　 相对于管家基因GAPDH和β-肌动蛋白引物，以量化选定基因和常见黑色素瘤肿瘤相关抗原MART-1基因表位和gp100的总表达。使用480SYBRGreenIMaster和Roche480进行定量扩增。用模板cDNA的连续稀释液验证扩增效率。所有样品均一式三份扩增，并将所得的结果取平均值。
　　 为了检测和测量总肿瘤浸润淋巴细胞群体中新表位特异性肿瘤浸润淋巴细胞的频率，定制了新表位特异性共轭肽或组织相容性复合物右旋聚合物。在肿瘤浸润淋巴细胞中，可以清楚地检测到KDLER2，MYLIP和SVIL表位的染色种群。CCT4右旋糖的染色非常弱，并且对于WDR75右旋糖几乎没有。此外，还产生了AGPS和ENC1的右旋体，这是泊松检测质谱法专门在患者细胞组织相容性复合物I类上检测到的新表位。与肿瘤浸润淋巴细胞刺激的结果一致，AGPS右旋聚物完全不结合肿瘤浸润淋巴细胞，而ENC1的染色水平较弱，无法与背景染色分开。另一方面，在患者肿瘤浸润淋巴细胞中，所有常规的右旋体染色均产生了明确的群体，与使用MART-1基因表位右旋体所见的染色相当。
　　 由于出国看病服务机构从突变的AGPS和ENC1基因中发现了两个新表位，它们在患者肿瘤组织相容性复合物I类上表达，但未被肿瘤浸润淋巴细胞识别，因此出国看病服务机构想确定这些表位是否对患者选择性非免疫原性，而对免疫广泛，或者，如果出国看病服务机构可以从健康供体中扩增新表位特异性T细胞。为了测试这些可能性，从患者或三名健康的人类白细胞抗原-A2供体或从患者和三名其他人类白细胞抗原-A2健康供体的血液中提取CD8T细胞。用肽脉冲的自体单核细胞衍生的刺激。筛选CD8T细胞识别每种肽的能力，这些肽要么被发现可激活肿瘤浸润淋巴细胞，要么被呈现在肿瘤细胞组织相容性复合物I类上。值得注意的是，对于患者，所有由肽刺激的外周血单核细胞培养物均具有可检测的新表位特异性CD8T细胞，如右旋聚合物阳性人群所示。对于KDELR2和WDR75，检测到高频率的强烈染色细胞，而对于AGPS，ENC1，MYLIP和SVIL，虽然染色细胞的频率较低，但染色强烈且明显。然而，对于CCT4，几乎没有细胞染色，并且染色也很弱，这表明细胞已经扩增但亲和力较低，这与患者肿瘤浸润淋巴细胞中的情况类似。相反，在模拟刺激的培养物中，对于任何个体，任何右旋体都没有染色。对于患者，所有肽都可在患者外周血单核细胞中扩增特定细胞，从而产生明确定义的右旋体染色的群体。在所有三个健康的供体中，NUP210和MART-1基因表位刺激均产生了清晰的右旋体阳性人群。
　　 因此，发现所有突变的肽都是免疫原性的，即使对于来自两个供体的血液的T细胞，自体肿瘤细胞系也来自两个供体。重要的是，在切除肿瘤很久之后便从这些患者身上抽血，而且他们当时都没有癌症。因此，在模拟刺激的血液中未发现肿瘤特异性细胞也就不足为奇了。然而，特别重要的是，即使是无法激活自体患者肿瘤浸润淋巴细胞的泊松检测质谱法定义的新表位也可以从患者外周血单核细胞和人类白细胞抗原A2供体外周血单核细胞扩增T细胞。
　　 出国看病服务机构还研究了源自患者外周血单核细胞或来自三个健康人类白细胞抗原A2供体的新表位特异性CD8T细胞是否可以识别患者肿瘤细胞。因此，用患者肿瘤细胞再次刺激受刺激的CD8，并通过FACS测量随着CD107a表达或脱粒增加而识别。患者新表位和MART-1基因表位特异性CD8T细胞的一部分识别了右旋体和CD107a双阳性细胞观察到的自体肿瘤。用NUP210或树突细胞T-1表位脉冲刺激的所有三个健康供体的CD8T细胞也可以识别患者肿瘤。作为阳性对照，对于每种新表位，用该肽重新刺激的CD8细胞，从而导致每个表位活化CD8T细胞。
　　 浸润的CD8T细胞介导了恶性黑色素瘤的主要免疫反应。因此，输注以CD8T细胞为主的体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞通常会导致转移性病变的完全和长期消退。但是，关于介导黑色素瘤患者肿瘤排斥的肿瘤源性T细胞的确切特异性，以及重要的肿瘤抗原决定簇来自广泛表达的共享肿瘤抗原或私人突变的肿瘤抗原决定簇的程度的信息有限。出国看病服务机构遵循两种平行但截然不同的策略来发现免疫原性新表位：一种基于从患者肿瘤中分离的T细胞的肽反应性，另一种基于对肿瘤细胞表面呈现的假定新表位的物理检测。
　　 出国看病服务机构对来自两个III或IV期转移性黑素瘤患者的早期传代肿瘤细胞系进行了全外显子组测序，以基于计算机预测的人类白细胞抗原A2结合和在黑素瘤中的预期表达来鉴定突变表位。与其他研究类似，出国看病服务机构专注于组织相容性复合物I类人类白细胞抗原A02受限制的抗原决定簇，其受更发达，更精确的算法的影响，这些算法可预测组织相容性复合物I类尤其是人类白细胞抗原A02的T细胞表位。此外，瑞典晚期黑素瘤患者的人类白细胞抗原A02患病率更高，尤其是那些预后较差的患者。