基因编辑和肿瘤细胞免疫疗法

　　虽然短回文重复序列相关蛋白系统用于多种细胞类型的基因编辑，但短回文重复序列相关蛋白系统向细胞内的递送仍然是有效基因组编辑的主要障碍。迄今为止，短回文重复序列相关蛋白系统递送的主要方法分为三种类型：病毒介导的递送，包括慢病毒，腺病毒和腺伴随病毒。非病毒介导的传递，包括脂质体，细胞穿透肽，DNA纳米线，精氨酸官能化的金纳米粒子。包括电转染等在内的物理传递。在这些方法中，考虑到由于不确定的染色体整合而导致的安全性问题，病毒载体通常仅限于实验研究。因此，基于脂质或聚合物的纳米载体可诱导细胞膜穿孔或胞吞作用，可能成为临床应用中短回文重复序列相关蛋白系统递送的潜在载体。最近，已证明具有细胞穿透肽固有功能的穿透细胞肽是一种在人细胞系中递送单向导RNA和Cas9蛋白的安全有效方法。此外，基于细胞快速机械变形会产生瞬态膜破坏的现象，从而促进生物大分子材料被动扩散到细胞质中，微流控膜变形方法已被开发出来，可将单向导RNA和Cas9蛋白输送到不同类型的细胞中并获得成功的基因组编辑。值得注意的是，微流体膜变形方法具有几个明显的优点，包括结构多样的生物大分子的相容性，难以转染的原代细胞的适用性，低细胞毒性和高通量传递。随着进一步的改进和发展，该方法可能为几乎任何类型的细胞提供安全且高通量的短回文重复序列相关蛋白系统递送策略，以供将来临床应用。
　　 细胞免疫疗法是一种新兴的治疗策略，有望在肿瘤中取得临床效果。免疫疗法的一种方法是免疫检查点抑制剂，例如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白，程序性细胞死亡蛋白及程序性细胞死亡蛋白配体1的阻滞。大量研究表明，短回文重复序列相关蛋白系统介导的程序性细胞死亡蛋白，程序性细胞死亡蛋白配体1或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白基因敲除是打破肿瘤治疗中基于T细胞的过继治疗耐受性的有效策略。几乎正在开展两项使用短回文重复序列相关蛋白系统通过灭活程序性细胞死亡蛋白来工程改造癌症患者T细胞的临床试验。
　　 另一方面，短回文重复序列相关蛋白系统也可用于取代天然基因座处的大型主要组织相容性复合体等位基因，这是一种在细胞移植中纠正主要组织相容性复合体错配的新颖方法。此外，作为一种强大的基因组编辑工具，短回文重复序列相关蛋白系统已发展成为哺乳动物细胞中基于功能的大规模筛选策略。通过这种策略，成功地将蛋白酪氨酸磷酸酶非受体2型鉴定为小鼠可移植肿瘤模型中的新癌症免疫治疗靶标。
　　 短回文重复序列相关蛋白系统介导的基因组编辑在基因治疗中最有吸引力的应用之一是嵌合抗原受体T细胞疗法细胞的产生。嵌合抗原受体通常包含识别并结合特定肿瘤相关抗原的细胞外单链可变片段和驱动T细胞活化的细胞内嵌合信号结构域。
　　 作为一种新的基因治疗方法，嵌合抗原受体T细胞疗法，尤其是CD19特异性嵌合抗原受体T细胞疗法在治疗B细胞急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤方面已显示出显着的抗肿瘤活性。然而，这种治疗也显示出神经毒性的体内，并且可以引起细胞因子释放综合征。另外，当前的主要嵌合抗原受体T细胞疗法细胞临床试验是通过收集患者的T细胞，对其进行修饰然后将其送回患者体内来进行的。这种定制方式在很大程度上取决于专用设备和熟练的技术人员。而且，难以从患有严重疾病的患者中收集足够的功能完整的自体细胞。T细胞的质量和数量不佳，再加上制造自体T细胞的时间和费用，极大地阻碍了嵌合抗原受体T细胞疗法在临床中的应用。因此，到目前为止，全世界只有少数医学中心能够生产和递送基因修饰的细胞用于临床治疗。为了克服临床治疗中的这些障碍，通过编辑来自一个供体的同种异体T细胞而制造的“通用”嵌合抗原受体T细胞疗法细胞已成为一种新策略，该嵌合抗原受体T细胞疗法细胞可用于其他多个患者。然而，同种异体T细胞上的内源性αβT细胞受体可能识别受体中的组织相容性抗原，从而导致移植物抗宿主病，并且同种异体T细胞表面通常表达人类白细胞抗原触发宿主的快速免疫排斥反应。鉴于强大的基因编辑效率，短回文重复序列相关蛋白系统已用于开发“通用”嵌合抗原受体T细胞疗法细胞。Eyquem的研究表明，使用短回文重复序列相关蛋白系统将CD19特异性CAR靶向T细胞受体α恒定基因座，不仅可以在人外周血T细胞中均匀表达CAR，而且可以增强T细胞活性。这一发现揭示了CARs免疫生物学的多个方面，并强调了短回文重复序列相关蛋白系统从基因组编辑到免疫治疗的潜在价值。除了能够产生通用嵌合抗原受体T细胞疗法细胞外，短回文重复序列相关蛋白系统介导的基因组编辑还被用于通过消除编码信号分子或T细胞抑制受体的基因来增强嵌合抗原受体T细胞疗法细胞的功能。专家用短回文重复序列相关蛋白系统成功产生了淋巴细胞活化基因3敲除的嵌合抗原受体T细胞疗法细胞，并证实在培养的嵌合抗原受体T细胞疗法细胞中没有检测到任何显着的生存力或免疫表型变化。在这项研究中，淋巴细胞活化基因3敲除的嵌合抗原受体T细胞疗法细胞在细胞系和异种移植小鼠模型中显示出强大的抗原特异性抗肿瘤活性。Lim表明，肿瘤细胞上的程序性细胞死亡蛋白配体1表达诱导人嵌合抗原受体T细胞疗法细胞功能低下，从而导致皮下异种移植小鼠模型中的肿瘤清除受损。为了克服这种抑制性反应，Cas9核糖核蛋白介导的基因编辑和慢病毒介导的基因转移系统的组合产生了程序性细胞死亡蛋白缺陷的抗CD19嵌合抗原受体T细胞疗法细胞。通过这种方式，他们通过程序性细胞死亡蛋白破坏增强了嵌合抗原受体T细胞疗法细胞介导的肿瘤细胞体外杀伤作用，并增强了程序性细胞死亡蛋白配体1异种移植物的体内清除率。Ren通过双重敲除内源性T细胞受体和I类急性淋巴细胞性白血病生成同种异体通用嵌合抗原受体T细胞疗法细胞。然后，他们以相同的方式破坏Fas受体，PD1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白，并最终通过一次成像系统完成了T细胞中的四倍基因破坏。
　　 尽管仍然存在某些挑战，但是基因编辑和肿瘤免疫疗法的巨大进步使其成为人类疾病基因治疗的有前途的方法。该系统可以在安全性，效率和脱靶性方面进一步提高，从而迅速地将其用于临床肿瘤治疗。