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基因组在癌症细胞免疫治疗中的应用 |
肿瘤发生是由多种基因改变驱动的,并且总是与复杂的免疫反应相关,这涉及肿瘤细胞的免疫逃逸和免疫抑制性肿瘤微环境的产生。
通过确定免疫检查点,例如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白和程序性细胞死亡蛋白,抗肿瘤免疫疗法已成为对抗肿瘤的最有希望的策略之一。
此外,癌症细胞免疫疗法,包括免疫检查点抑制剂的利用和嵌合抗原受体T细胞疗法,在临床试验中已显示出显着的抗肿瘤活性。所有这些方法都可以通过对患者免疫细胞进行基因编辑来实现。近来,已确定簇状规则间隔的短回文重复序列系统,一种RNA引导的DNA靶向技术,是基因编辑中一种特别通用且操作简单的系统。它也已经以其强大的基因编辑效率被用于促进治疗性免疫细胞产物的产生。在这篇综述中,出国看病服务机构将讨论短回文重复序列相关蛋白系统在基因编辑中的机制,递送和应用,重点关注癌症细胞免疫疗法中的应用和挑战。
在遗传学和功能基因组研究中,对广泛的物种内源基因组基因座进行精确而高效的编辑一直是研究人员追求的目标。短回文重复序列系统最初是在原核生物中发现的,是适应性免疫系统的一部分,可帮助宿主防御来自质粒和病毒的外源核酸的入侵。专家于1987年首次报道了短回文重复序列系统在大肠杆菌中的结构,Jansen进一步鉴定了几种细菌或古细菌中的结构,并于2002年将其命名为短回文重复序列系统。Mojica报道说,短回文重复序列系统包含与外源核酸具有序列同源性的高变间隔子,并推测短回文重复序列系统可能在2005年参与了宿主对入侵核酸的免疫防御。有专家在2012年揭示了短回文重复序列系统在原核生物中的工作机制。此后不久,其他科学家在基因组编辑领域取得了突破,即短回文重复序列系统成功地应用于哺乳动物细胞的基因组编辑。通常,短回文重复序列系统包含短回文重复序列系统关联编码Cas核酸酶的基因,短回文重复序列系统RNA阵列包含20nt向导RNA和独特的重复元件阵列,这些重复元件由外源DNA片段和反式激活短回文重复序列系统RNA衍生的短可变序列隔开。在另一方面,引导RNA靶向DNA区域内,每个入侵的短片段DNA总是伴随有入侵的短片段DNA相邻基序,根据特定系统短回文重复序列系统而变化。作为基因组编辑工具,短回文重复序列相关蛋白系统包括两部分:Cas9内切核酸酶和通过将短回文重复序列系统RNA和短回文重复序列系统RNA融合在一起人工创建的单向导RNA。Cas9识别单向导RNA并形成蛋白质RNA复合物,该复合物进一步与目标DNA片段的互补碱基对结合,并引导Cas9裂解DNA双链并产生双链断裂。基因组位点。然后,通过内源性DNA修复机制通过或同源定向修复,这将导致随机突变或精确的基因编辑通过应用外源DNA修复模板。两种方式都可能导致基因敲除或在连接位点敲入。
将RNA指导的短回文重复序列系统Cas核酸酶系统具有简单明显的优势,靶向效率和可操作性,现已提供序列特异性的可编程的基因组编辑的技术,如锌指核酸酶和转录活化剂样效应核酸酶比较。大量研究证明,短回文重复序列相关蛋白系统可以在哺乳动物细胞系,动物模型或其他物种中快速方便地实现基因组编辑。因此,短回文重复序列相关蛋白系统已被用作基因治疗的有希望的候选者。截至目前,它已被用于正确的基因突变,产生嵌合抗原受体T细胞疗法细胞和癌症研究[溶瘤病毒创建。2016年,一个中国研究小组在临床试验中报道了第一例Cas9应用案例,该案例是将Cas9工程化的程序性细胞死亡蛋白缺失T细胞注射入侵袭性非小细胞肺癌患者中,结果令人鼓舞。另一方面,短回文重复序列相关蛋白系统已被用于基于功能的高通量基因筛选,这也使功能丧失和功能获得的筛选比以往更加有效和可靠。除基因组编辑外,Cas9核酸酶还可以通过聚合酶链反应介导的定点诱变来禁用其DNA切割活性,从而转化为RNA引导的DNA识别平台,从而产生核酸内切酶灭活的“死Cas9”。“死Cas9”可以与引导RNA共表达以产生DNA识别复合物,该复合物通过干扰转录延伸,RNA聚合酶结合或转录因子结合而选择性地干扰基因表达。
由于Cas9可以无选择性地与不同的单向导RNA结合,因此该特性可以一次实现高效的多重基因编辑。然而,使用Cas9系统实现多重基因编辑需要大型构建体或同时递送编码Cas9和短回文重复序列系统RNA的多个质粒,因此肯定会增加脱靶切割的频率。短回文重复序列相关蛋白系统在基因编辑应用中面临的主要挑战之一是在不良基因组位点发生的脱靶切割。为了减少脱靶切割,应设计与靶基因具有高度序列同源性的指导RNA。此外,Cas9-短回文重复序列系统RNA应该通过质粒或病毒载体进行传递,这样可以最大程度地减少指导RNA合成中产生的潜在突变。最近,已开发出工程或天然直系同源的Cas9蛋白来提高其特异性和效率。
目前,一些Cas9直系同源蛋白已经被工程化用于基因组编辑,例如常用的化脓性链球菌Cas9和金黄色葡萄球菌Cas9,它们比化脓性链球菌Cas9小大约1kb。在2015年,专家识别的天然氨基酸球菌Cpf1,其为推定的效应物短回文重复序列系统为人类基因组编辑,并将其命名为Cpf1,其比为化脓性链球菌Cas9导的RNA显示更相容。2017年,专家通过短回文重复序列系统Cpf1系统成功地在人细胞中实现了多重基因编辑,该系统是一个人工短回文重复序列系统短回文重复序列系统RNA阵列,由四个间隔区组成,这些间隔区由来自弗朗西斯菌新孢子虫和两个Cpf1直系同源物。 |
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