如何从恶性T细胞中分离出健康的T细胞

　　利用自体嵌合抗原受体T细胞疗法治疗T细胞恶性肿瘤的最大挑战之一是从恶性T细胞中分离出健康的T细胞，以产生未被癌性T细胞污染的嵌合抗原受体T细胞产物。迄今为止，宾夕法尼亚大学已报告一例单个白血病B细胞的CD19-嵌合抗原受体修饰，导致CD19阳性复发并最终导致患者死亡。当患者的一部分T细胞为恶性肿瘤时，分离健康T细胞的任务就更加困难，尤其是在T细胞白血病中，循环T细胞的可能性很高的情况下。因此，制造用于治疗T细胞恶性肿瘤的自体嵌合抗原受体T细胞具有产生嵌合抗原受体修饰的白血病细胞的极高可能性。这可能会导致复发，因为这些细胞可能会逃避正常嵌合抗原受体-T细胞的识别。
　　 另外，出国看病服务机构发现，使用患者自己的细胞来制造嵌合抗原受体T细胞仍然面临许多挑战。接受嵌合抗原受体T细胞疗法治疗的晚期疾病患者通常经过大量的预处理，之前已经进行了许多轮化疗，这可能会导致T细胞计数低或T细胞可能不足以使其健康扩展而使其变得非常困难制造有效的嵌合抗原受体T细胞产物。由于与老化相关幼稚T细胞的比例降低此问题在许多成年患者更为普遍。另外，考虑到这些患者中有许多患有晚期疾病，患者可能会在制造自体嵌合抗原受体T细胞的过程中经历疾病进展，合并症甚至死亡。在大多数复发性T细胞恶性肿瘤中尤其如此，其本质上趋向于侵袭性和化学抗性。最后，每种起始的自体T细胞产物都是不同的-可变功能，成熟度，CD4或CD8比率和表型比率-每种单独产物的异质性导致了不可预测的结果和可变的治疗效果。
　　 自体嵌合抗原受体T细胞制造的一种替代方法是使用异体T细胞作为细胞来源。为了使该方法可行，必须封闭同种异体嵌合抗原受体T细胞中内源性α、βT细胞受体的表达，因为这很可能会导致移植物抗宿主病，除非供体是人类白细胞抗原匹配者。此过程涉及从健康供体进行白细胞分离，然后分离供体的T细胞。用编码嵌合抗原受体的逆转录病毒载体转导T细胞后，需要对TRAC基因座进行后续的基因组编辑，以防止内源T细胞受体的表达。然后，在冷冻保存之前，从扩增的嵌合抗原受体T细胞产物中去除保留T细胞受体阳性的细胞。这将产生一种“现成的”细胞产品，可以将其存储起来，直到需要治疗为止。这种方法导致在用TRAC和CD52基因座修饰的同种异体CD19-嵌合抗原受体T细胞治疗的两名婴儿B细胞急性淋巴细胞白血病病例中成功缓解。异体嵌合抗原受体T细胞持续存在，直到适应干细胞移植。另一组利用shRNA敲低β2-微球蛋白，并结合了将CD19-嵌合抗原受体插入TRAC基因座的敲入策略。敲除β2-微球蛋白会降低I类人类白细胞抗原分子在细胞表面形成异二聚体的能力。减少β2-微球蛋白和TRAC的表达导致CD8T细胞和自然杀伤细胞的同种异体攻击减少。这种策略可能有助于减少接受嵌合抗原受体T细胞疗法的患者的同种异体识别。其它基团已经利用在临床前嵌合抗原受体T细胞靶向调查CD7和CD3类似的方法。
　　 CRISPR-Cas9基因组编辑已成为防止基因表达或纠正基因表达的流行技术。一项针对CD7的研究使用CRISPR-Cas9破坏CD7和TRAC基因座，产生了“抗杀虫剂，同种异体耐受”嵌合抗原受体T细胞。当用野生型供体T细胞处理时，植入了原代T细胞急性淋巴细胞白血病细胞的小鼠会产生移植物抗宿主病。然而，用嵌合抗原受体T7供体细胞治疗的小鼠能够清除外周血中的肿瘤细胞，此外，还没有出现移植物抗宿主病或其他严重的副作用。TALENs是一种替代性的基因组编辑技术，也已用于防止TRAC基因座的表达，以限制抗CD3-嵌合抗原受体T细胞的杀伤力并防止外来宿主细胞的组织相容性复合物识别。编辑TRAC基因座的基因组会阻止T细胞受体α、β或CD3复合物的稳定装配。在用抗CD3-嵌合抗原受体慢病毒载体转导之前，先用TALENmRNA破坏TRAC基因座，产生的嵌合抗原受体T细胞增殖良好，大大降低了人类白血病小鼠模型的肿瘤负担。
　　 如上所述，近来已经开发了蛋白表达阻断剂以选择性地防止单个蛋白质的表达。已经显示，蛋白表达阻断剂可有效地将CD3保留在高尔基体中，以防止在异体使用抗CD19嵌合抗原受体T细胞的过程中对宿主细胞进行组织相容性复合物识别。T细胞受体α、β信号的破坏对T细胞增殖没有影响。在用蛋白表达阻断剂-CD19-嵌合抗原受体T细胞治疗的小鼠白血病模型中，没有证据显示移植物抗宿主病，而在不表达CD3蛋白表达阻断剂的嵌合抗原受体T细胞治疗的小鼠中，有60％出现了移植物抗宿主病。此外，蛋白表达阻断剂和嵌合抗原受体均可使用2A序列从同一载体中表达，导致仅一次细胞转导。尽管这项研究将蛋白表达阻断剂与抗CD19-嵌合抗原受体结合使用，但该系统可以与其他嵌合抗原受体构建体一起应用于靶向T细胞抗原。当前正在探索许多途径来增强嵌合抗原受体治疗的安全性和有效性。然而，这些策略中的大多数并未解决使用嵌合抗原受体疗法治疗T细胞恶性肿瘤的所有三个主要挑战。在这篇综述中评估的方法中，只有那些掺入自然杀伤细胞或自然杀伤-92细胞的方法有可能克服所有这些主要挑战。自然杀伤细胞是非同种异体的，可以从健康供体获得，从而消除了产品污染的风险；不形成记忆反应，防止T细胞发育不良；不表达与T细胞相同的抗原库，从而避免了杀伤力。CD7是一个例外，因为它在自然杀伤细胞上表达，因此可能会发生杀伤分子。尽管有几个研究小组发表了针对靶向T细胞恶性肿瘤的嵌合抗原受体自然杀伤-92细胞的研究，但尤其是考虑到自然杀伤-92细胞的局限性，使用原代自然杀伤细胞靶向这种疾病需要付出更多的努力。其他同样有希望的方法，例如利用T细胞作为用于嵌合抗原受体治疗的细胞载体，代表了另一种方法，但研究较少。与自然杀伤细胞相似T细胞是非同种异体反应的，不太可能形成针对T细胞抗原的记忆反应。在某些情况下，靶向仅导致瞬时杀伤性杀伤剂的抗原例如CD5可能是特别有利的。此外，T细胞表现出固有的组织相容性复合物依赖性细胞毒性机制，从而可以识别肿瘤细胞。因此，使用T细胞的嵌合抗原受体疗法代表了一种尚未被研究的途径，具有发展成为优质细胞产物的潜力。T细胞具有固有的组织相容性复合物依赖性细胞毒性机制，可以识别肿瘤细胞。因此，使用T细胞的嵌合抗原受体疗法代表了一种尚未被研究的途径，具有发展成为优质细胞产物的潜力。T细胞具有固有的组织相容性复合物依赖性细胞毒性机制，可以识别肿瘤细胞。因此，使用T细胞的嵌合抗原受体疗法代表了一种尚未被研究的途径，具有发展成为优质细胞产物的潜力。