EGFR突变的非小细胞肺癌

　　免疫检查点调节正在成为肺癌进展的关键因素，而免疫检查点抑制剂代表了晚期EGFR和ALK野生型非小细胞肺癌患者的新治疗标准。在预处理过的非小细胞肺癌中；与多西他赛相比，抗PD-1/PD-L1治疗可显着提高EGFR野生型队列的总生存率，但不能改善EGFR突变组的总生存率。然而，仍存在争议，即在获得酪氨酸激酶抑制剂耐药后，在疾病进展过程中EGFR突变的NSCLCs的免疫情况如何变化，这可能是免疫疗法在这些患者的临床管理中的作用。在这里，我们报告了四名在TKI治疗上进展的EGFR突变NSCLC患者的分子特征和免疫学特征。对未治疗和耐药的病变均进行了分子改变，PD-L1表达，肿瘤浸润淋巴细胞以及395种与免疫反应相关的基因的基于下一代测序的基因表达分析。
　　 用TKI治疗4例具有EGFR激活突变的IV期肺腺癌患者。在疾病进展期间，使用CobasEGFR突变测试v2对患者进行血液收集，以寻求EGFR耐药性突变。还在进行组织活检以进行组织学和分子表征。通过Cobas实时测定法或下一代测序基因突变小组对福尔马林固定和石蜡包埋的样品中的EGFR状态进行了重新评估。MET基因扩增使用METIQFISH探针和CEP7进行评估。
　　 研究了Oncomine免疫应答研究测定法中PD-L1IHC的表达，TIL和免疫应答相关基因的表达。根据专家提出的方案，由专业病理学家对TILs进行评估。使用在AutostainerLink48中开发的具有Agilent-Dako22C3克隆的免疫组织化学分析CE-IVDPD-L1IHC22C3pharmDx在肿瘤细胞上评估PD-L1的表达。对从福尔马林固定和石蜡包埋的样品中提取的RNA进行基因处理表达测定OIRRA靶向395个免疫相关基因。使用TorrentSuite免疫应答RNA插件对基因表达水平进行定量，该插件根据序列读取数据产生了基因转录本定量。使用Affymetrix转录组分析控制台3.1软件对来自运行的标准化基因水平计数数据进行进一步分析，以比较样本在开始和发展过程中的表达水平。
　　 所有患者均已就诊断过程中收集的任何生物样本的存储以及将这些样本用于研究目的达成了知情同意。
　　 疾病发作时发现的所有EGFR激活突变在液体活检和组织活检中都保留在进展过程中。仅在一种情况下，液体活检为阴性，而在随后的活检中发现了主要的EGFR突变。患者已接受一线抗EGFRTKI一线治疗，直至疾病进展。确定了不同的治疗抗性机制，包括EGFRT790M突变和MET复制数增加。在情况2中，在奥西替尼治疗期间观察到表型转变为小细胞肺癌。此外，TP53和MET分别在2例和1例的组织活检过程中发现了突变。
　　 除一个样本外，其他所有样本的TILs评估均为阴性。仅在情况＃2中，PD-L1染色呈强阳性，但在SCLC转化过程中免疫反应性丧失。在病例4中，在疾病进展时评估的病变中检测到PD-L1的阳性率很低。在进展中，在病例＃1中PD-L1mRNA表达上调而在病例＃2中PD-L1mRNA表达下调。
　　 在OIRRA研究组的395个基因中，在所有情况下，三种基因的表达水平在疾病进展过程中均显示出统计学上的显着差异，而与潜在的获得性耐药机制无关。在整个进展过程中，CXCR2被上调，而ITGAL和NT5E或CD73被下调。此外，在所有病例中，病变处的MMP9表达也被上调，尽管差异没有统计学意义。对每种情况下差异表达基因的分析显示，在原发性和再活检样品之间存在上调或下调的其他免疫相关标记。在情况2中，对具有表型转换的EGFRT790M突变阳性肝转移和后osimertinib肺定位进行了测定。在SCLC标本中，观察到CCL22，PDCD1和IDO1表达强烈下调。CA4和NCAM1或CD56是最上调的基因。
　　 在EGFR-TKI上/后进展的EGFR突变的NSCLC患者中，免疫疗法的作用仍存在争议。尽管没有证据表明EGFR突变患者的抗PD1/PD-L1作为多线紫杉醇的二线治疗优于多西紫杉醇，但EGFR突变的肿瘤生物学与PD-1/PD的复杂相互作用-L1信号传导和免疫反应仍有待阐明。在这项初步研究中，我们对在EGFR-TKI治疗期间进展的四种原型EGFR突变的NSCLC进行了肿瘤和肿瘤微环境免疫特征的全面表征。
　　 通过免疫组织化学评估的PD-L1表达代表了对抗PD1/PD-L1抑制剂反应最广泛使用和验证的生物标记。关于PD-L1表达与EGFR突变之间相关性的报道已有争议。在获得性耐药的情况下，与T790M阴性病例相比，具有T790MEGFR突变的肿瘤中观察到PD-L1表达的比率较低。在我们的系列中，四分之三的病例在未进行TKI治疗的样本中均未显示PD-L1染色，在一个病例中，在进行性T790M阴性后的样本中检测到弱阳性。在一种情况下，PD-L1表达出现在疾病发作时和没有TIL的最初进展中。如先前报道。在mRNA水平上，一个病例显示PD-L1的表达上调未通过免疫组织化学检测到，另一例具有1％的PD-L1肿瘤细胞染色，但无mRNA表达。这些技术的不同敏感性和用于分析的不同部分可能会消除这些细微的差异。而且，仅在肿瘤细胞中评估了免疫组织化学表达，而mRNA水平表明了在肿瘤细胞及其微环境中的表达。
　　 独立于获得的疾病进展基础的耐药机制，检测到两个通常上调的基因和下调的基因。趋化因子受体CXCR1/2和它们的配体CXCL8对于活化是必要的，贩卖炎性细胞的和它们的抑制已被报道提高免疫治疗疗效。专家研究表明，CXCR2可以通过基质金属肽酶9上调来促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭。实际上，我们还观察到MMP9的表达增加在进行中的所有标本中。MMP9激活参与肿瘤的新血管生成和转移，其高表达被认为是肺腺癌患者的不良预后因素。专家结果表明，用抗PD-L1抗体治疗可降低胰腺癌和肝转移中MMP9的表达。ITGAL和NT5E在进展中均被下调。ITGAL编码LFA-1的整联蛋白亚基，这对于嗜中性粒细胞募集至发炎的组织至关重要。ITGAL的下调与细胞和体液免疫的下调有关。NT5E或CD73在肿瘤微环境中引起细胞外腺苷的积累，从而促进肿瘤的免疫逃逸和对免疫检查点抑制剂的抵抗。NT5E表达在EGFR阳性肿瘤中经常观察到，并且与低IFN-γ信号分子有关。体外研究已经表明，靶向NT5E促进与T细胞抑制剂的检查点，化学疗法或过继细胞疗法。目前正在进行I期临床试验，以评估抗CD73或A2A拮抗剂与PD-1/PD-L1抑制剂的组合。在我们的系列中，我们检测到进展期的NT5E表达水平低于病灶，表明在TKI治疗期间肿瘤免疫力有所调节。
　　 在＃2病例中，观察到一系列不同的获得性对EGFR-TKIs的耐药机制，包括吉非替尼一线治疗后的T790MEGFR突变和奥西替尼治疗后向SCLC的表型转化。如专家最近报道的，在SCLC样品中发现了EGFRT790M突变的丢失。此外，我们观察到以微调CCL22，PDCD1，PDL1和IDO1为特征的炎症微环境降低。还检测到CA4和NCAM1的上调。NCAM1表达与神经内分泌转化密切相关。
　　 总之，这些初步数据突显了在EGFR-TKI治疗后进展的EGFR阳性NSCLC中肿瘤的复杂动力学和肿瘤微环境免疫谱。我们观察到治疗后免疫标志物表达的显着变化，这可能会增加肿瘤进展时的免疫原性，并支持这些患者免疫治疗的可能作用。此外，不同的获得性抗药性机制可能归因于这些免疫相关标记的差异表达。有必要对大范围的局部肿瘤免疫调节进行完整的评估，以准确鉴定出在抗EGFR靶向治疗失败之前，联合使用或之后可能受益于不同免疫疗法的患者。