男性乳腺癌中的启动子高甲基化

　　除遗传改变外，表观遗传事件在癌症的发展和进程中也很重要。启动子区域CpG岛的超甲基化是最能表征的表观遗传变化，并且是沉默肿瘤抑制基因的常见机制。甲基化是可逆的，因此是有吸引力的治疗靶标，可作为治疗反应和预后的标志物。甲基化在几乎所有类型的癌症中都非常普遍，但也可以是生理事件，如基因组印迹。甲基化参与女性乳腺癌的发展，在导管原位癌和浸润性导管癌中，PAX6，BRCA2，PAX5，WT1，CDH13和MSH6频繁甲基化。相反，甲基化在雌激素受体阴性，淋巴结阴性和BRCA1相关的女性乳腺癌中较少见。甲基化被认为是在女性乳腺癌的肿瘤发生的早期事件，并且因此特定基因的甲基化状态可以是如在临床实践潜在目标的筛选有用。尽管已经证明两者之间似乎存在重要差异，但大多数针对男性乳腺癌的诊断和治疗算法都是根据女性乳腺癌推断出来的。男性乳癌是更经常激素阳性而HER2-amplified和基底样乳腺癌在男性中罕见的。癌基因激活的不同基因和机制在男性乳腺癌的致癌作用中也发挥着作用：高水平扩增在男性乳腺癌中较少见，但整个染色体臂的增加在男性乳腺癌中更常见。由于甲基化在致癌过程中具有重要意义，因此甲基化在男性乳腺癌的发展中也可能很重要，但这尚未得到研究。有几种技术可用于评估甲基化。甲基化特异性多重连接依赖探针扩增技术可在一个PCR反应中同时评估多种基因的甲基化状态。与此高通量的方法，其中显示与其它甲基化特异性技术良好的相关性，可以得到在几个重要的肿瘤抑制基因的甲基化的可靠总体视图。在这项研究中使用MS-MLPA研究几种重要的抑癌基因甲基化在男性乳腺癌中的作用。将甲基化模式与临床病理特征和预后相关联。还将结果与一组女性乳腺癌进行比较。
　　 1986年至2010年，从荷兰的四个不同病理学实验室收集110例连续的浸润性男性乳腺癌手术标本。H＆E幻灯片由三名经验丰富的观察员进行审核，以确认诊断并根据当前标准进行分类和分级。病理报告用于检索年龄，肿瘤大小和淋巴结状态的信息。这些患者的平均年龄为66岁。肿瘤大小为0.8至5.5厘米。在86％的病例中，已知淋巴结状态，其中55％的患者有淋巴结转移。根据世界卫生组织大多数病例被诊断为浸润性导管癌。其余病例为小叶，混合型，浸润性筛状，乳头状，粘液性，浸润性微乳头状或腺样囊性癌。根据改良的Bloom和Richardson评分，大多数肿瘤为2级或3级。如前所述以每2mm2为11的平均有丝分裂指数评估有丝分裂活性。对于所有情况，均如先前所述重新评估了激素受体和HER2的状态。组织微阵列玻片用于ER和孕激素受体的免疫组织化学染色，以及用于HER2评估的生色原位杂交。大多数肿瘤是ER阳性和PR阳性，而HER2扩增很少。另外，从10次尸检中获得正常的男性乳房组织。这些患者没有乳腺肿瘤病史。切除乳晕下区域，固定在4％福尔马林中后，解剖并包埋在石蜡中。从这些块中切出4μm切片，并对其H和E进行染色；如果存在导管，则将导管最丰富的区域切开以进行DNA分离。与研究组织匿名使用冗余组织是与出国看病服务机构医院患者进行的标准治疗协议的一部分。
　　 在H和E染色的载玻片上确定代表性的肿瘤区域，并用手术刀从8μm石蜡载玻片上切开相应的区域。通过在56℃下在蛋白酶K中孵育过夜来提取DNA。MS-MLPA根据制造商的说明书上进行，使用Veriti96孔热循环仪。ME002-B1试剂盒，包含25个抑癌基因，如以前一样使用[4]。两种不同的CpG探针可用于基因MGMT和RB1。MS-MLPA的原理已在其他地方进行了详细介绍。简而言之，MS-MLPA试剂盒包含用于甲基化定量的探针，与常规的多重连接依赖性探针扩增中的探针相似，不同之处在于MS-MLPA探针检测到的序列包含甲基化敏感性HhaI酶的限制性位点。DNA变性并与探针混合物孵育过夜后，将样品分成两支试管，其中一根与HhaI孵育。在该试管中，未甲基化的DNA被消化，不会通过PCR指数扩增。因为甲基化的DNA不能被HhaI消化，将这些探针连接起来，然后通过PCR进行扩增。在有和没有HhaI的情况下孵育的探针之间的比率可以估算出甲基化状态。每次MS-MLPA运行时均采取适当的阴性和阳性对照。通过在ABI3730毛细管测序仪上的电泳分离PCR产物。使用Genescanv4.1和Coffalyserv9.4软件进行甲基化分析。通过将一个样品中每个探针的信号除以每个参考探针的信号来计算相对探针峰。对于最终的甲基化状态，针对每个探针计算未消化样品和相应的消化样品的相对探针峰之比。如果一个基因存在两个CpG基因座，则计算平均甲基化状态以供进一步分析。启动子甲基化率>0.15被视为指示启动子甲基化，根据细胞系的实验和以前的经验。累积甲基化指数计算为所有基因的甲基化百分比之和。
　　 先前描述的一组女性乳腺癌用于比较男性和女性乳腺癌中启动子的高甲基化。该组由33例浸润性导管癌患者组成，平均年龄为55岁。肿瘤大小为0.5至6.5厘米。平均有丝分裂活性为每2mm214，根据修正的Bloom和Richardson评分，大多数肿瘤为2级或3级。ER阳性很常见，而71％的肿瘤是PR阳性。HER2扩增出现在两个案例中。使用相同的肿瘤抑制试剂盒。使用SPSSforWindowsv15.0针对双面P进行统计计算。<0.05显着，通过连续变量的方差分析和分类变量的Pearson卡方检验来计算启动子高甲基化与临床病理特征之间的相关性。将以下临床病理特征分为两部分：年龄，肿瘤大小，有丝分裂计数和组织学分级。曼惠特尼检验用于计算CMI和临床病理特征的差异。用Spearman的rho计算甲基化基因的数量与临床病理特征之间的相关性。使用统计程序R进行分析以分析相关的簇和共甲基化。使用绝对甲基化百分比，并将所有甲基化<5％的情况汇总在一起。进行逻辑回归分析以比较男性和女性乳腺癌中的甲基化，并考虑到两组之间的重大临床病理差异。使用向后逐步方法，直到保留最可预测的变量。生存数据来自荷兰综合癌症登记局。有101例患者的结果数据，平均随访5.7年。因此，生存分析基于5年生存率。对于单变量生存分析，绘制Kaplan-Meier曲线，并使用对数秩检验进行分析。采用Cox回归进行多变量生存分析。根据最可预测的阈值，将CMI和甲基化基因的数目二分以用于生存分析。
　　 在两名男性乳腺癌病例中，DNA量不足，有108例病例需要进一步分析。25个分析的抑癌基因的甲基化状态。除一个病例外，所有病例均显示至少一个基因的甲基化，平均六个基因。甲基化对于MSH6，WT1，PAX5和CDH13非常普遍。相反甲基化在RB1，BRCA1，CDKN2A，VHL，ATM和CHFR中非常罕见。平均CMI为364。在三例尸检中男性尸检发现男性乳房发育。其他7例具有正常的男性乳腺导管。在基因MSH6，ESR1，PAX5和CDH13中发现甲基化。在所有其他基因中均未发现甲基化。平均CMI也很低，为16。较高的CMI与高有丝分裂计数和高有丝分裂计数相关。在3级癌症中，甲基化基因的数量显着更高，并与高平均有丝分裂计数相关。两个单独的基因与更具侵略性的表型相关：ESR1和GSTP1甲基化的肿瘤的平均有丝分裂计数更高。这两个基因也与高等级相关。对于ESR1，九个甲基化肿瘤中有八个是3级肿瘤，对于GSTP1在47个甲基化的肿瘤中，有25个为3级。最后，具有MGMT甲基化的肿瘤的平均肿瘤大小为3.2cm，与没有MGMT甲基化的肿瘤相比，平均肿瘤大小明显更大。一方面，没有任何基因与年龄，淋巴结，PR和HER2状态之间存在关联。层次聚类分析揭示了三类聚簇基因。一组由基因WT1，CDH13，MSH6，PAX5，GSTP1，GATA5和PAX6组成，其中甲基化非常普遍的七个基因。确实，在15％的情况下，所有这些基因都显示出甲基化。第二簇是由具有中等甲基化率的基因形成的。在第三组中，其余基因聚集在一起。在这些基因中，甲基化极少。对于所有患者，未将男性乳腺癌病例分为明显的明显簇。至少可以鉴定出四个不同的组，并且这些簇没有显示出明显的临床病理特征。一个案例不适合任何组。该3级男性乳腺癌病例在几乎所有基因中均显示出较高的甲基化率。
　　 由于乳腺癌是一种异质性疾病，因此仅比较管腔型男性乳腺癌和管腔型女性乳腺癌。在这种方法中，年龄是两组之间唯一显着不同的临床病理特征。男性乳腺癌患者年龄明显更大。管腔型男性和管腔型女性乳腺癌中25个研究基因的甲基化状态。在男性乳腺癌中，多种基因的甲基化频率要低得多。特别是，与女性乳腺癌相比，ESR1，BRCA1和BRCA2甲基化的频率较低，并且在逻辑回归分析中是性别的强烈独立预测因子。基因CD44，RARB，ATM和STK11在男性乳腺癌中也显示出较低的甲基化频率。另一方面，男女乳腺癌中MSH6，PAX5，PAX6和CDH13的甲基化频率较高。在以性别为决定因素的逻辑回归分析中，仅考虑了年龄，因为两组之间的其他临床病理特征均无显着差异。当不考虑年龄并使用Pearson卡方检验时，男性乳腺癌中PTEN和VHL的甲基化也明显较少。在男性乳腺癌中，没有一个被研究的基因被更频繁地甲基化。3级，高有丝分裂计数和大肿瘤尺寸与预期的5年生存率降低相关。尽管具有GATA5甲基化的肿瘤表现出5年生存率下降的趋势，但没有任何甲基化基因与患者的预后显着相关。但是，当使用六个甲基化基因的阈值将甲基化基因的数目二等分时，与甲基化基因少于六个的肿瘤相比，具有六个或更多甲基化基因的组的存活率显着降低，但不是Cox回归的重要独立预后因素。高CMI的肿瘤也降低了生存率和高CMI是Cox回归的独立预测因素。
　　 启动子高甲基化是重要的基因沉默机制，被认为是致癌作用的早期事件。了解在男性乳腺癌表观遗传学的作用是重要的，以进一步深入了解男性乳房致癌作用和用于鉴定潜在生物标志物的诊断和治疗。尚未对男性乳腺癌的表观遗传学变化进行研究，因此使用高通量MS-MLPA方法在108名患有这种罕见疾病的患者中调查启动子的高甲基化，从而能够评估多种基因的甲基化状态一轮PCR。毫不奇怪，甲基化确实发生在男性乳腺癌中。MSH6，WT1，PAX5，CDH13，GATA5和PAX6基因在超过50％的病例中显示启动子高度甲基化，表明基因可能经常与男性乳腺癌的发生有关。这些基因所必需的几个器官系统的正常发育或播放在DNA修复，细胞粘附，细胞生长和迁移的作用，虽然其中一些基因的功能仍然知之甚少。两个等位基因的功能丧失导致这些基因的完全敲低，这可能促进恶性转化。甲基化与基因之一的异常沉默可能是引发事件，第二次击中或两者同时发生。MSH6甲基化在正常男性乳腺癌中也很常见，尽管其频率低于出国看病服务机构的男性乳腺癌病例组。在10例正常男性乳房组织中，未发现男性乳腺癌中其他常见的甲基化基因被甲基化，这证实了甲基化在男性乳腺癌发展中的重要作用。在男性乳腺癌中，甲基化在BRCA1，CDKN2A，VHL，ATM和CHFR中非常罕见，这表明这些基因的甲基化似乎在男性乳腺癌的发生中没有发挥重要作用。
　　 具有侵略性表型的男性乳腺癌的甲基化基因数量增加，CMI更高。此外，具有六个或更多甲基化基因或高CMI的肿瘤的预后较差。当校正等级，有丝分裂计数和肿瘤大小时，高CMI甚至是生存不良的独立预测因子。这表明甲基化基因的积累和总体较高的甲基化状态似乎在生存力较弱的男性乳腺癌的发展中很重要。高度乳腺癌的标志是遗传不稳定性，在男性乳腺癌中似乎包括甲基化基因的积累。类似的趋势注意到在女性乳腺癌，和女性乳腺癌患者与越来越多的甲基化基因的也有不利的结果。鉴定出两个甲基化与高有丝分裂计数和高等级相关的单基因：ESR1和GSTP1。高档乳腺癌被认为是由与低档乳腺癌比较获得不同的遗传和表观遗传变化从高档前期病变出现。ESR1和GSTP1甲基化在这些高级男性乳腺癌的发生中可能很重要。GSTP1属于代谢酶家族，通过与谷胱甘肽结合而参与致癌物和化学治疗剂的解毒。在女性乳腺癌中，GSTP1甲基化与高档导管癌相关原位和高档浸润性乳腺癌，淋巴结转移和转归不良存在]。由ESR1编码的ER是乳腺癌的重要因素，因为对女性的研究表明，荷尔蒙阴性肿瘤患者无法从内分泌治疗中获益。无法证明ESR1之间的关系甲基化和ER表达，尽管需要谨慎解释，因为108例中只有7例是ER阴性。另一项最新研究还得出结论，ESR1甲基化与蛋白质表达之间的关系较弱，不太可能代表ER沉默的主要机制。甲基化和TWIST的表达之间也没有关系，因此这可能并不罕见。为了进一步探讨这种关系，需要更大范围的ER阴性男性乳腺癌病例。与女性乳腺癌相似，ESR1的甲基化似乎是高恶性男性乳腺癌的生物标志物。确实，女性乳腺癌ESR1启动子甲基化水平高与预后不良有关。在男性乳腺癌组中，ESR1甲基化和GSTP1甲基化与不良的生存率没有显着相关，因此在男性乳腺癌中似乎不是有用的预后生物标志物。
　　 与女性乳腺癌相比，在一些研究的基因中，尤其是ESR1，BRCA1和BRCA2，甲基化在男性乳腺癌中较少见。使用相同的方法和相似的截断标准，分别在2％和18％的男性乳腺癌中遇到了BRCA1和BRCA2启动子的高甲基化，但是在18％和64％的女性乳腺癌中发现BRCA1和BRCA2启动子的高甲基化。结果表明，在甲基化方面女性和男性乳腺癌的致癌作用之间可能存在重要的差异。BRCA1甲基化在相对年轻的绝经前女性中更为常见，这可以解释女性乳腺癌的发病率较高，因为男性乳腺癌患者的年龄明显大于女性乳腺癌患者。但在本研究中，逻辑回归中校正年龄，因此，性别差异在这里似乎也起作用。遗传易感性的差异也可能影响这些肿瘤的表观遗传学特征，并且可能是导致男性和女性乳腺癌之间启动子高甲基化的某些差异的原因。已知约有10％的乳腺癌患者具有遗传易感性，尤其是BRCA2突变似乎很重要。很遗憾，没有关于BRCA的数据这两个队列均可以使用种系突变，但在男性乳腺癌组中似乎有较高的隐藏BRCA2突变携带者发生率。BRCA2突变携带者的这种较高比率可能很好地解释了与女性乳腺癌相比，男性乳腺癌组中BRCA2启动子高甲基化的比率较低。男性乳腺癌中甲基化频繁的基因在女性乳腺癌中也很常见。使用相同技术获得两组的甲基化状态。但是，用手术刀对男性乳腺癌病例进行显微解剖，对女性乳腺癌病例进行激光显微解剖。尽管后一种方法更为精确，但认为这可能不会影响出国看病服务机构的结果。男性乳腺癌肿瘤非常大，并且肿瘤细胞丰富，因此可以根据手术刀解剖方法将其很好地收集用于DNA分离。此外，多重连接依赖性探针扩增对肿瘤细胞含量相对不敏感。甲基化似乎在男性乳腺癌的发展中很重要。超过50％的肿瘤在MSH6，WT1，PAX5，CDH13，GATA5和PAX6中显示甲基化。甲基化基因的积累和总体高甲基化状态与更具攻击性的表型和较差的存活率相关。ESR1和GSTP1是与有丝分裂活跃和高级男性乳腺癌相关的唯一单一基因。与女性乳腺癌相比，男性乳腺癌中甲基化发生的频率更低。另一方面，最常见的甲基化基因在男性和女性乳腺癌之间共享。出国看病服务机构的结果指出了男性和女性乳腺癌之间在致癌性方面的差异，这些差异隐藏在相似之处之后。