正在考虑从胚胎脊索的残部出现，脊索瘤是一种非常罕见的和生长缓慢的恶性间质肿瘤。在临床上，脊索瘤占所有骨恶性肿瘤的1-4％，并且具有每百万少于一情况的年龄调整发病率。如脊索瘤通常反应差对常规化疗和放射治疗，治疗目前脊索瘤的基石，是手术完全切除，这已被建议是最重要的因素影响脊索瘤复发和长期患者存活。然而，许多患者还会有肿瘤手术后复发的患者5-40％，甚至有可能发生转移，这对在有效临床治疗的一大挑战，并预测疾病的临床过程。目前，尽管在脊索瘤的诊断，治疗方式和分子理解方面取得了重大进展，但其预后仍然令人沮丧。因此，迫切需要开发新颖的脊索瘤特异性分子靶标以改善患者的治疗干预和预后预测。
　　 在PD-1/PD-L1途径的免疫检查点被认为代表一个机制，使癌症可以逃避宿主的抗肿瘤免疫监视。先前的临床试验已经显示，PD-1/PD-L1抑制剂在不同类型的癌症中均具有令人鼓舞的结果。免疫检查点阻断治疗的基本原理被认为是直接激活T细胞，特别是CD8细胞毒性肿瘤浸润淋巴细胞，在肿瘤微环境。除了上述机制外，几种可抑制免疫抑制Foxp3基于抗体的药物调节性T淋巴细胞途径。作为肿瘤免疫的主要参与者，CD8的TIL和Foxp3肿瘤浸润淋巴细胞被发现与患者的生存相关的人类癌症的许多形式。迄今为止，PD-1/PD-L1轴的TIL和表达模式已经在文献中脊索瘤描述。然而，脊索瘤肿瘤病变中不同TIL亚群的特征，尤其是CD8TIL和Foxp3TIL的特征仍然未知。微RNA是短内源性非编码RNA分子的家族，其功能是抑制蛋白质通过互补相互作用与靶信使RNA的3'-UTR编码基因表达的。以前的研究已经表明的miRNA在脊索瘤发育，生长，进展和预后牵连。然而，关于脊索瘤中的miRNA与PD-1/PD-L1信号通路之间的相互作用了解甚少。
　　 当前，已经进行了许多研究来研究脊索瘤分子生物学，并发现了用于风险分层的几种候选预后生物标志物。然而，由于跨脊索瘤的肿瘤细胞的异质性，尚未建立此类生物标记物的广泛临床应用。近年来，在病理学评价中肿瘤免疫微环境越来越受到重视，可以为预后提供有意义的新信息。此外，肿瘤区域内的免疫参数对预后的意义优于传统的分期。旨在讨论PD-L1表达，微环境TIL密度，在脊柱脊索瘤切除术中，以及与脊柱脊索瘤患者的临床病理特征或预后相关。海外医疗网研究人员还试图通过miRNA芯片和生物信息学分析来鉴定可能调节脊髓脊索瘤中PD-L1表达的miRNA，并评估miRNA轴表达对患者生存的影响。
　　 回顾性收集2002年6月至2015年4月在我科接受手术治疗的54例脊柱脊索瘤患者的54份肿瘤组织标本。作为正常对照，还从20例在同一时期接受手术的椎间盘突出症患者中取出20个髓核组织样本。这两个患者组以前在研究人员的研究中已有描述。此前接受过化学疗法或放射疗法以及任何其他类型的肿瘤特异性疗法的患者被排除在本研究之外。回顾性分析临床病理数据，包括年龄，性别，肿瘤大小，位置，肿瘤等级，分期，周围肌肉浸润，术前复发，切除类型，肿瘤出血和坏死。根据用于恶性骨和软组织肿瘤的分期手术的Enneking外科分期系统肿瘤分级和分期进行评价。切除的肿瘤标本由解剖病理学家评估，并根据Enneking原则记录为Enneking适当或Enneking不适当。由脊索瘤周围肌肉侵袭通过术前的磁共振图像和术后病理证实。先前接受过肿瘤切除并在入院时已确认复发的患者记录了术前肿瘤复发。
　　 手术后立即将两个患者组的组织样品立即固定在10％福尔马林缓冲液中，并包埋在石蜡中。从病理学部门取回肿瘤和正常组织的福尔马林固定石蜡包埋块，并加工成4um厚的切片。脊索瘤的诊断是由两名病理学家根据先前发表的标准对H＆E染色的肿瘤组织切片进行组织学检查后做出的。术后头2年每3个月对患者进行临床和影像学随访，术后3年每6个月随访一次，此后每年进行随访。局部复发的诊断期间的第二次手术随访或组织学是基于临床表现和成像发现。局部无复发生存期定义为从手术日期到诊断出首次局部复发的时间间隔。同样，OS被定义为肿瘤切除与任何原因死亡之间的间隔。对该患者无肿瘤或活着之前的观察进行检查，直至2015年9月。
　　 按照制造商的说明，使用mirVanaTMRNA分离试剂盒从54个FFPE脊索瘤组织和20个FFPE髓核样品中提取总RNA。通过Nano-Drop2000分光光度计测量样品RNA的浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳和28S和18S的溴乙锭染色评估完整性。miRNA芯片数据是直接从研究人员之前的研究中获得的，并经受相同的分析。使用双面t检验和倍数变化来选择差异表达的miRNA。使用miRNA芯片数据有三个在线互补计算数据库通过反向算法来识别可能调节脊髓脊索瘤组织中PD-L1表达的潜在miRNA。在各种人类恶性肿瘤的正或上调PD-L1表达包括脊索瘤，研究人员仅将miRNA芯片结果中被下调的miRNA视为候选miRNA。根据制造商的规程，使用miRNA逆转录试剂盒将组织样品中的总RNA逆转录为cDNA。的qPCR是使用的TaqMan进行通用PCR主混合物。进行熔解曲线分析以确认在PCR循环结束时特异性扩增的PCR产物的产生。使用方法计算相对miRNA表达水平，并将U6snRNA用作内源性对照。所有实验均重复三次。
　　 免疫组织化学，使用过氧化物酶标记的链霉生物素技术如前面所述执行的处理。简而言之，将4-um的薄片在二甲苯中脱蜡，并用分级乙醇溶液再水化，然后在压力锅中于127°C的pH7.0的EDTA缓冲液中暴露于抗原中15分钟。然后，将组织切片与3％H2O2孵育在甲醇中溶解15分钟，以淬灭潜在的内源性过氧化物酶活性。接下来，将切片在10％的正常山羊血清中于室温孵育30分钟，以在PBS中洗涤3次后阻断非特异性结合。此后，切片以1:20的稀释度用抗CD8的原抗Foxp3，抗PD-1，1：400稀释，抗PD-L1抗体1:50的稀释液和抗Ki-67在4°C下以1：100的稀释液过夜。第二天，将组织切片用PBS洗涤，然后与第二生物素化的山羊抗兔免疫球蛋白在37°C孵育30分钟，其次是链霉亲和素-过氧化物酶偶联物。最后，加入3，3'-二氨基联苯胺溶液以可视化抗体结合，并用苏木精轻轻染色。阴性对照是通过用PBS代替一抗而创建的，阳性对照切片来自人非恶性淋巴结组织，如先前所建议的。
　　 免疫组织化学结果由两名经验丰富的病理学家独立评估，他们对所呈现的临床结果视而不见。的TIL的整体程度如前所述上使用半定量评价标准满H＆E切片评估，以及TIL的被判定为：不存在，稀有，中度或突出。然后，如果观察到的得分为0-1，则将组织样本分类为阴性；如果另外观察到的得分为2-3，则将其分类为阳性。Foxp3，CD8，PD-1和PD-L1的TIL通过相同的评分量表进行分析，并记录为不存在，稀有，中度或突出。将肿瘤组织中的Ki-67指数记录为核染色阳性细胞的百分比，将这些数据分为低和高Ki-67表达。PD-L1表达定义为阳性，如果肿瘤细胞大于等于5％有膜染色。如先前所描述染色的Foxp3，CD8，PD-1和PD-L1载玻片进行的TIL的自动图像分析。简要地说，使用尼康的倒置EclipseTi显微镜在TIL密度较高或代表整个TIL分布的区域中查看切片，并使用NikonDS-Ri1-U3数码相机获取图像。使用NIS-Elements图像分析软件AR3.0。Foxp3+，CD8+，PD-1+和PD-L1+的枚举然后使用计算机辅助图像分析方法在五个热点中进行TIL。最后，计算每单位面积的阳性染色细胞数，并获得平均密度。
　　 所有统计分析均使用SPSS17.0进行。在适当的情况下，使用Studentt检验或单向ANOVA检验分析两个连续变量，并使用卡方检验或Wilcoxon秩和检验分析分类变量。皮尔逊相关检验用于检验两个连续变量之间的关系。选择差异表达的miRNA的阈值设置为P值≤0.05，倍数变化大于等于2且错误发现率＜0.05，计算出该值以校正P值。CutoffFinderWeb应用程序用于确定预后分析的阈值，它被定义为分裂最明显的点。用Kaplan–Meier方法估计LRFS和OS曲线，并通过对数秩检验通过单变量分析确定存活概率的差异。多变量Cox比例风险模型通过包含在单变量分析中显着的变量，用于识别与LRFS和OS显着相关的独立因素。所有测试均为双面测试，P值≤0.05被认为具有统计学意义。
　　 本院收治的54例脊髓脊索瘤患者均行根治性切除。男35例，女19例，平均年龄55.59±13.56岁。43例患有原发性脊索瘤，11例复发。所有患者均患有常规脊索瘤亚型，随访至2015年9月，平均随访期为42.39个月。根据研究人员先前的选择标准与髓核组织相比，脊索瘤中有182种2006年人类成熟的miRNA差异表达。其中，上调了110个，下调了72个。发现六个下调的miRNA可能调节PD-L1表达。定量RT-PCR结果证实了miRNA芯片的发现，除了miR-371b-5p，发现在脊索瘤和髓核组织之间的表达没有显着差异。但是，进一步的分析仅显示miR-574-3p与PD-L1之间存在显着的逆相关性。脊索瘤组织中miR-574-3p的表达水平明显低于髓核样品中的表达水平。此外，miR-574-3p表达降低的脊索瘤与更高的肌肉浸润和更严重的肿瘤坏死显着相关。在54例患者中的37例中，PD-L1表达在肿瘤细胞中呈阳性。相比之下，PD-L1在髓核组织中表达20例中的5例和差异有统计学显著。研究人员还发现，PD-L1表达阳性的患者表现出晚期阶段。
　　 总体而言，评估H＆E切片后，所有54个患者样品中都存在TIL。具体而言，总的TIL水平在23例中很少或为少数，在15例中为中，在16例中为突出。因此，总的TIL表达在23例中为阴性，在31例中为阳性。PD-1和PD-L1在所有54个样品的TIL中均表达。肿瘤内PD-1和PD-L1TILs的平均密度分别为151.8细胞/mm2和288.0细胞/mm2。PD-1增加TIL浸润与肿瘤对周围肌肉组织的较高浸润有关。然而，低水平的PD-L1TILs与较高的病理学分级，晚期和活动性脊柱肿瘤位置相关。脊索瘤组织中CD8或Foxp3TIL的模式分为四类。平均肿瘤内CD8或的Foxp3的TIL密度，和CD8的TIL的比例分别为311.0细胞/毫米2，132.0个/mm2和3.3，分别为。但是，在CD8或Foxp3TILs密度或CD8比率与所检查的临床病理变量之间没有统计学上的显着相关性。
　　 具有PD-L1阳性表达的肿瘤更容易发生淋巴细胞肿瘤浸润。但是，发现在脊索瘤微环境中，肿瘤miR-574-3p表达与TIL浸润没有显着相关性。PD-L1表达阳性的脊索瘤组织中PD-1TIL的平均密度明显高于PD-L1表达阴性的脊索瘤组织。然而，在肿瘤微环境中，PD-L1表达阴性的脊索瘤倾向于具有比PD-L1表达阳性的脊索瘤更多的PD-L1TIL。对于CD8比率也发现了类似的观察结果，在PD-L1表达的肿瘤中比CD-L1阴性的肿瘤要低。但是，单独的Foxp3TIL或CD8TIL与PD-L1表达没有显着相关性。CD8比率与miR-574-3p表达密切相关。研究人员还观察到PD-1和PD-L1密度之间以及CD8TIL和Foxp3TIL密度之间存在适度的相关性。此外，CD8比例与PD-1和CD8的数量相关。在随访期间，有41例患者局部复发，有24例患者死亡。估计的1年和3年LRFS率分别为70.1％和9.6％，而估计的1年，3年，5年和10年OS率分别为88.4％，51.6％，44.1％和35.3％。LRFS和OS的中位数分别为21.0个月和48.0个月。
　　 miR-574-3p和TIL与LRFS和OS相关的预后临界值。根据临界值将患者分为高表达或低表达组。Kaplan-Meier分析表明，高的肿瘤的miR-574-3p表达在统计学上更好LRFS相关联。此外，PD-L1和在肿瘤细胞中的miR-574-3p的共表达与显著LRFS。亚组分析表明，与阳性PD-L1和高表达miR-574-3p的肿瘤相比，阳性PD-L1和低表达miR-574-3p的患者生存率低得多。此外，研究人员发现PD-1以及CD8的水平与LRFS有统计学意义。多变量分析表明，TILs中PD-1的表达以及肿瘤周围肌肉的侵袭是LRFS的独立预测因子。而且，CD8比率比单独的CD8具有更强的统计学意义的LRFS预后价值，尽管这种预后意义不显着。
　　 关于OS，Kaplan-Meier分析表明，肿瘤高表达miR-574-3p与更好的OS有统计学联系。在OS和高CD8比率或PD-L1密度之间也观察到类似的关联。但是，PD-1TIL或Foxp3TIL密度高的患者的OS较差。PD-L1和miR-574-3p在肿瘤细胞中的共表达与OS显着相关。然而，患者之间生存结果没有显著差异与PD-L1的miR和PD-L1的miR-574-3p脊索瘤表型。多元Cox比例风险模型显示CD8比率与死亡风险显着相关。但是，当分析中包括Foxp3而不是CD8比率时，没有发现任何参数可以独立预测OS。
　　 在当前的研究中，研究人员评估了PD-L1表达的概况，并募集了TILs及其在脊髓脊索瘤中的临床病理意义。还尝试使用微阵列和生物信息学分析及其可能对患者预后的影响，确定可能调节脊髓脊索瘤中PD-L1表达的miRNA。观察到PD-L1与miR-574-3p之间存在反相关关系，表明其在PD-L1表达中的潜在调节功能。肿瘤PD-L1表达与TIL浸润和晚期脊索瘤分期显着相关，而miR-574-3p表达与更高的肿瘤肌肉浸润，更严重的肿瘤坏死和CD8增加有关比。此外，发现PD-L1阴性和miR-574-3p高表达的患者亚组具有改善的生存率和降低的复发率。对于与TIL相关的肿瘤微环境，研究人员发现脊索瘤组织中经常存在TIL，并且这些免疫细胞以相关方式分布。研究的所有TIL亚型以及CD8比率均与LRFS和OS显着相关。此外，高水平的PD-1阳性淋巴细胞浸润与不良的LRFS独立相关。CD8比率是OS的独立预测因子。这些发现可能有助于将患者分为预后组，并为可能通过针对脊髓性脊索瘤中的miR-574-3p的检查点封锁疗法的使用提供理论依据。
　　 最近，对PD-1/PD-L1轴的抗体阻断已显示出对几种晚期人类癌症的有效疗效。初步研究结果表明，免疫检查点抑制剂的临床反应与对肿瘤细胞的升高的PD-L1表达相关。因此，评估肿瘤PD-L1表达的概况对于选择可能受益于免疫检查点治疗的患者至关重要。PD-L1在大多数脊索瘤试样，与大多数人类实体肿瘤样品中的PD-L1免疫阳性的以前的报告中包括脊索瘤一致表示。目前，在脊索瘤中PD-L1上调的确切分子机制仍然难以捉摸。缺氧诱导因子1α在脊索瘤组织中频繁表达。这将是有趣的，推断是脊索瘤PD-L1上调可能由缺氧条件被诱导。此外PD-L1的上调可以响应于外源性炎症信号而被诱导或由组成型致癌信号通路驱动。研究表明PD-L1与CD8之间无显着关联TILs，提示肿瘤内在途径可能是脊索瘤中PD-L1过表达的主要机制。
　　 在研究中使用miRNA芯片和生物信息学分析来鉴定上游差异表达的miRNA，这些miRNA可能与脊索瘤中PD-L1表达的调节有关。研究人员发现，与相应的髓核组织相比，脊索瘤样品中的miR-574-3p明显下调。此外，观察到miR-574-3p和PD-L1表达之间显着的负相关性，这表明miR-574-3p在PD-L1表达中具有潜在的调节作用。miR-574-3p可能是在一些人类癌症中肿瘤抑制和也具有较高的相关性Gleason评分以及晚期肿瘤期前列腺癌标本。即减少的miR-574-3p表达与脊柱脊索瘤患者不良的临床病理特征和生存结果有关。此外，还表明携带阳性PD-L1表达的脊索瘤与晚期阶段相关。更重要的是，低miR-574-3p和高PD-L1表达水平的组合将生存结果较差的患者与生存期延长的患者区分开了。综上所述，这些结果表明脊索瘤中miR-574-3p表达的下调可能通过靶向PD-1/PD-L1途径发挥其致癌功能，从而促进了由于肿瘤免疫逃逸而导致的脊索瘤细胞的增殖和侵袭。可能通过施用miR-574-3p模拟物靶向PD-L1，可能是脊索瘤的潜在治疗策略。
　　 许多与脊髓脊索瘤预后相关的生物标志物。然而，由于潜在的肿瘤间和肿瘤内异质性，仍然没有可靠的分子标记来预测脊索瘤的临床结果和药物治疗反应。对肿瘤免疫微环境的分析可能较少受肿瘤异质性的影响。另外，已经提出病理免疫评估可以提供关于预后的更有效信息，这可能会增加传统分期的重要性。研究人员集中于CD8TILs和Foxp3的脊髓脊索瘤肿瘤微环境TIL。发现肿瘤内CD8TILs比率高的患者亚组的LRFS和OS均有改善。若干研究作出此比率在食管鳞状细胞癌，侵袭性乳腺癌和骨肉瘤良好预后的权利要求。此外，根据研究还确定在食管癌预后中，CD8比单独使用CD8或Foxp3TILs是更有效的指标。这些发现表明，CD8之间存在相互作用的TIL和Foxp3TIL的人类癌症，包括脊索瘤。还发现PD-1TILs的肿瘤内浸润独立预测脊髓脊索瘤的不良生存。软组织肉瘤和透明细胞肾细胞癌对肿瘤浸润PD-1阳性淋巴细胞阴性预后含义协议。然而最近的研究结果，没有显示出病人的生存和PD-L1阳性T细胞浸润之间显著的关联，这从一个荟萃分析违背了研究人员之前的报告。这种不一致可能归因于评估PD-L1时使用的不同定义和方法TIL以及多变量分析中包括的不同预后因素集。
　　 为了证实研究人员的发现，需要更多的大样本前瞻性研究来验证研究人员当前的数据。缺乏目标基因功能验证和细胞功能实验。需要进一步的研究来证明脊索瘤中完整的miR-574-3p介导的PD-L1信号网络，并确定其表达如何影响患者的临床结局。还应注意，使用最小P值方法可能导致对生存的真实影响的高估。用这种方法来二分连续预测，因为它使研究人员能够将患者再进行临床管理方面的建议，因为在预后研究它的广泛使用。此外，没有单独分析肿瘤微环境中不同子区域的TIL，例如癌基质，浸润边缘或癌细胞巢。最后，还可以评估肿瘤微环境中的其他种类的免疫细胞，例如CD3，CD4，CD57，CD68和CD66b细胞，以使人们能够更准确地了解免疫微环境参数及其在脊索瘤中的预后作用。
　　 这项研究确定了miR-574-3p是脊索瘤中PD-L1表达的潜在调节剂。miR-574-3p轴的表达与脊髓脊索瘤患者的临床病理和免疫特征显着相关。CD8比例和TIL亚群的数量对患者的预后有明显的预后影响。这些发现可能有助于将患者分为预后组，并为可能通过针对脊髓性脊索瘤中的miR-574-3p的检查点封锁疗法的使用提供理论依据。但是，仍然需要进一步的研究来确定完整的miRNA介导的PD-L1信号网络，并评估肿瘤微环境的免疫成分是否可以作为脊髓脊索瘤的有效预测标记。