脊索瘤是罕见的,缓慢生长的,局部侵袭性的骨肿瘤,其起源于脊索的胚胎残余,并表现出双重上皮-间质分化。这些肿瘤通常发生在轴向骨骼中,并且对颅底和骨的蝶枕区和pro骨区具有倾向性。它们起源于the骨约50–60%,颅底区域约25–35%,颈椎约10%和胸腰椎大约5%的病例中有椎骨。脊索瘤被认为具有低转移潜力。但是,多达43%的患者向肺,骨骼,软组织,淋巴结,肝脏和皮肤的远处转移。脊索瘤的典型特征是physaliferous细胞,其簇状大细胞被纤维隔分隔成小叶,并被富含粘蛋白和糖原的嗜碱性细胞外基质包围。根据形态,脊索瘤可分为经典,软骨样变和去分化。尽管脊索瘤已在组织学上进行了研究,但对驱动这些肿瘤的分子机制了解甚少。
下一代测序及其与相关技术的集成已实现了对个人群体的广泛基因组分析,包括其转录组的鉴定和定量。与微阵列技术相比,RNA测序是更准确的,并提供关于所述癌症转录更多的信息。本研究的目的是确定脊柱脊索瘤或颅底脊索瘤特异和共有的候选生物标志物。为此,对脊柱脊索瘤的RNA-Seq进行了分析,并与海外医疗网研究人员先前发表的颅底脊索瘤中生成的RNA-Seq数据一起进行了分析。进行了计算机内途径分析,以确定此类基因的潜在生物学和疾病功能,以帮助选择潜在的生物标记。最后,确认在蛋白质水平上选择的一组候选生物标记,并为了验证RNA-Seq结果,进行了IHC分析。另外,为了鉴定在脊柱和颅底脊索瘤中也可用作治疗靶标的生物标志物,本研究有助于阐明这两种脊索瘤亚型的表型变异。
研究人群包括37例原发性颅底脊索瘤患者和32例原发性脊柱脊索瘤患者,他们可获得临床数据和FFPE标本。选择六个正常鼻甲组织的不匹配FFPE标本作为参考。机构审查委员会批准了这项研究。在涉及人类参与者的研究中进行的所有程序均符合机构和国家研究委员会的道德标准,并符合1964年的《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案或类似的道德标准。组织学诊断已由专门的头颈病理学家,软组织病理学家和神经病理学家确认。从32个脊柱脊索瘤中提取总RNA,并通过核糖体RNA消耗进行富集。被成功用于30个样品产生的全转录链特异性cDNA文库。在HiSeq2000平台上对30个脊柱脊索瘤的文库样品进行RNA测序,并从RNA插入物的每个末端获得50bp的配对末端读数。
然后将所得的30个脊柱脊索瘤样品的RNA-Seq数据与先前生成的21个颅底脊索瘤的RNA-Seq数据和六个正常组织标本结合起来进行RNA-Seq分析。在所有57个样本中,调整后的读取深度范围为50-68百万。每个样本的目标读取中位数为5200万。所有RNA测序数据都可以从美国国家生物技术信息中心序列阅读器档案下载。使用RNAv9管线进行RNA-Seq分析。分析包括来自EAQuintiles数据库的基因和转录本标识符信息,涵盖34,495个基因和88,933个同工型转录本。对57个组织标本进行RNA-Seq数据质量控制分析,主要是对不居中和基因居中数据的上四分位数归一化和对数转换的基因计数进行主成分分析,得出了统计上一致且可靠的数据,用于三个正常样本的亚型比较分析组织,14个颅底脊索瘤和12个脊柱脊索瘤样本。对于每个脊索瘤亚型,这产生了27,349个基因转录本和70,420个同工型转录本,代表了颅底脊索瘤和脊柱脊索瘤的整个人类转录组,包括长的非编码RNA,但不包括核糖体,小的非编码RNA和对照转录本。在比对分析过程中会自动识别并注释基因和转录本。
这些完整的转录组表用于使用log2倍数变化大于1加上严格的FDR小于0.015且未经调整的p值小于5.1E的严格标准来选择颅底脊索瘤或脊柱脊索瘤的基因和同工型转录本-4,或对于转录异构体,FDR小于0.022,未调整的p值小于2.0E4。未知注释使用NCBIEntrez基因,ENSEMBL和UCSC基因组浏览器数据库手动更新。接下来比较头骨基础脊索瘤或脊柱脊索瘤的特征基因和异构体转录表,以产生三组基因和转录本:头骨基础脊索瘤所特有的基因,脊柱脊索瘤所特有的那些和这两种脊索瘤亚型共有的。然后使用这三个基因组,分别是222、261和192个差异表达基因,来创建30-41个基因和转录本的面板列表,这些基因组和转录本最差地上调和下调,并根据其生物学功能和亚细胞分类位置。
与三个正常样品相比,针对14个颅底和12个脊柱脊索瘤样品进行了聚类分析的热图,根据它们的log2FC表达值,对前100个差异表达的基因和同工型进行了分析。包括相似性簇,基于样本的欧几里得距离,将它们的前100个基因和前100个同工型表达进行比较,计算为平均连锁聚类。所有的聚类和热图分析以及差异表达基因的可视化均由EAQuintiles使用R2.15.1软件包进行。为了验证通过RNA-Seq分析鉴定的基因表达谱,研究人员使用了免疫组织化学来评估某些候选基因的蛋白表达,这些候选基因在颅底或脊椎脊索瘤中高度上调并且被认为很重要。IHC用针对RAB3B的抗体进行,该抗体在正常组织以及颅底和脊索脊索瘤中表达;T和HOXA3,在颅底和脊椎脊索瘤中均表达;LMX1A,主要在颅底脊索瘤中表达;SALL3仅在脊索脊索瘤中表达。
26例将脊索瘤标本包括在亚型比较分析中的患者的临床特征。颅底脊索瘤患者的诊断年龄为6至74岁,脊柱脊索瘤的诊断年龄为33至80岁。多数患有颅底或脊柱脊索瘤的患者均为男性。在患有颅底脊索瘤的患者中,最常见的原发肿瘤部位是锁骨。在脊柱脊索瘤患者中,大多数原发性肿瘤平均分布在胸,腰和,骨脊椎中。颅底脊索瘤患者和脊柱脊索瘤患者的主要形态学亚型都是常规的。对前100个基因和转录本的平均连锁簇分析显示,来自HOXA簇的HOXA1和HOXA2以及ZIC1,ZIC4和FOXD1在颅底脊索瘤中均被上调,而HOXA2,HOXA3,HOXA4,HOXA5和HOXC8从HOXA和HOXC簇,带T一起,在脊柱脊索瘤被上调。
基于前5000个亚型转录本的表达数据,对29个脊索瘤样品之间的差异进行层次聚类分析,结果表明没有主要的组分离,而是从底部的正常样品到顶部的样品连续变化,主要由颅底标本。但是,分析显示了两个不同的群集组。最高的群集组由七个颅底脊索瘤标本和四个脊柱脊索瘤标本所占主导地位,第二群集的组由五个颅骨基脊索瘤标本占主导地位,甚至包括一个正常组织标本。这种聚集可能与每个肿瘤组织样品的严重程度和阶段有关。该小组列出了三组中上调和下调最强的前30-41个基因和转录本:颅底脊索瘤独特,脊柱脊索瘤独特,两种脊索瘤亚型共有,并根据其生物学功能和亚细胞位置分类介绍了假定在确定颅底和脊柱脊索瘤的疾病亚型中起主要作用的主要候选药物。比较这些面板显示出颅底和脊柱脊索瘤亚型之间的主要差异和共同点。
在上调的转录相关基因上很容易看到最明显的差异。两种脊索瘤亚型均表达转录因子T,LMX1A,FOXD1和HOXA簇基因HOXA1,HOXA2和HOXA3,它们均参与发育和分化。脊柱脊索瘤还表达了其他转录相关基因,包括其他HOXA簇成员,HOXB簇成员和HOXC簇成员以及发育相关的转录调节因子SALL3,干细胞标记物HOPX和细胞周期激活剂ZNF695。脊柱脊索瘤还主要表达转录因子ZNF385B,其功能尚不清楚。它可能与细胞凋亡有关。相反,颅底脊索瘤不表达其他HOX簇基因,但强烈表达与发育相关的转录因子ZIC1,ZIC4和LHX4,已知它们激活致癌性WNT途径,并且转录后调节剂NANOS,它促进肿瘤细胞的侵袭并有助于保持干细胞的状态。
颅底与脊柱脊索瘤之间第二个最显着的差异出现在信号相关基因和蛋白质上调的类别中。在脊柱脊索瘤中,最突出的信号基因是声波刺猬,以其同名信号通路而闻名,它参与了发育和细胞间分化。脊柱脊索瘤还具有上调DDIT4L基因的功能,这表明mTOR信号通路受到抑制,这与干细胞分化,细胞增殖和凋亡抑制有关。脊柱脊索瘤中其他上调的基因包括ARHGAP40,MRGPRX3,POPDC3,PKD1L2和ADGRD1,它们参与G蛋白及其直接靶标的信号传导。相反,颅底脊索瘤的PBK上调,这与致癌的FOXM1通路和p53信号通路的抑制有关,从而加速细胞周期的进展和增殖;以及DIO1的上调,DIO1是甲状腺激素T3信号通路对生长,分化和基础代谢必不可少的一部分。颅底脊索瘤仅过表达G蛋白信号传导中涉及的一种成分,即食欲素受体HCRTR1。在颅底和脊柱脊索瘤之间差异表达的其他基因和转录物主要与细胞内结构,重塑,分解代谢,囊泡转运,膜成分,细胞外基质和细胞粘附有关。这些基因和转录本也对每个脊索瘤亚型的表型做出了重要贡献。
每个脊索瘤亚型中最高度下调的基因和转录物主要影响与发育和分化,膜和细胞结构以及肿瘤抑制和免疫防御反应有关的细胞功能。在这种情况下,有趣的是大量下调的免疫系统相关基因和转录本,尤其是编码的滤泡性树突状细胞分泌蛋白FDCSP,它与树突状细胞免疫反应有关,以及与先天性免疫反应相关的基因BPIFA1,BPIFB1,BPIFB2和BPIFB3,它们在颅底和脊椎脊索瘤中均受到抑制。最后,研究人员发现仅在颅底脊索瘤,仅脊柱脊索瘤和两种脊索瘤亚型中分别有21、19和8个未知基因或转录本上调或下调。假设它们中的大多数属于具有未知调节功能的非编码RNA,但其中至少有12种似乎也被编码为具有未知功能的蛋白质。与疾病和生物功能相关的基因和转录本的IPA在头骨基脊索瘤中鉴定出207种这样的基因和转录本,其中155种与癌症有关。脊柱脊索瘤中有239例,其中178例与癌症有关;颅底和脊柱脊索瘤中有181例,其中144例与癌症有关。的IPA结果证实的开发-和分化相关基因的强有力的贡献,并作为网络分析表明,鉴定不仅那些常见的两种亚型脊索瘤,而且那些特定于每个疾病亚型。
针对五个代表性发育相关基因和膜蛋白编码基因RAB3B的抗体进行了IHC分析,所有这两种RNA-Seq分析均显示在两种脊索瘤亚型之一中都高度上调。这些基因对应的差异基因表达值分别为14、11、9、9、7和8。IHC结果证实了研究人员的RNA-Seq基因结果,但亚型特异性程度不同。IHC表明LMX1A表达在颅底脊索瘤比在脊柱脊索瘤中,而RNA测序分析的组共有的脊索瘤亚型基因在包括LMX1A。IHC在脊柱脊索瘤中显示高SALL3表达,在颅底脊索瘤中显示低SALL3表达,而RNA-Seq分析将SALL3包括在脊柱脊索瘤特异的基因组中。IHC显示T中,HOXA3中,LHX4中和RAB3B在颅底和脊椎脊索瘤中。在基因水平上,这些IHC结果与RNA-Seq分析的结果相符,除了LHX4和RAB3B外。总之,这些结果表明,具有针对LMX1A和SALL3的抗体的IHC使研究人员能够区分脊索瘤亚型。这些结果还清楚地表明,至少对于所选靶蛋白,脊索瘤亚型之间的差异不是绝对的,因为所有测试的蛋白质均在两种脊索瘤亚型中表达,但水平差异很大。
研究人员先前的颅底脊索瘤研究和本研究的发现表明脊柱和颅底脊索瘤均来自脊索干细胞。本研究结果最好地证明了这一主张,即192个基因在颅底和脊索脊索瘤中均等地表达差异,并且许多基因和转录本在脊柱或颅底中主要而非唯一地表达差异脊索瘤。本研究的IHC结果在蛋白质水平上也支持了这一点,该结果表明蛋白质在亚型之间主要而非唯一地表达差异。因此,这两种脊索瘤亚型之间的差异可能是局部周围组织发出信号和某些基因组损伤的结果,这会阻止已改变的细胞完全分化并保护其免受免疫和损伤反应凋亡,衰老。在这方面,这两种脊索瘤亚型之间最明显的差异是差异表达的上调发育基因:颅底脊索瘤似乎在第一个HOX簇上具有HOX基因簇途径的中止表达,
除了它们的启动子调控的,基因簇主要由表观遗传学和过增强子调节,因此影响到这些调节机制,而不是发育基因的直接突变缺陷,可能会导致在颅骨的分化方案的变化基础脊索瘤与脊柱脊索瘤。颅底脊索瘤似乎通过改变分化途径以过度表达发育转录因子ZIC1,ZIC4和LHX4来绕过这些缺陷。这里负责这些脊索瘤亚型的主要因素取决于转录物,基因和蛋白质的支持网络途径。在脊柱脊索瘤中,这些支持网络途径的许多成分,例如SALL3,ZNF385B转录因子和SHH信号传导途径,似乎仍然活跃并有助于使分化趋向于体细胞状态。相反,颅底脊索瘤似乎不能从干细胞状态中分化出来,因此可以更快地发展成更稳定和更具侵略性的癌症干细胞。脊柱和颅底脊索瘤中大多数强烈下调,差异表达的转录本和基因主要与免疫和损伤反应有关,它们在这些脊索瘤亚型中的作用似乎相当明显。
本研究的发现表明,脊柱和颅底脊索瘤是由遗传损伤引起和驱动的,从而导致发育和分化相关途径的失控,从而导致脊索干细胞分化为癌症干细胞而不是周围的体细胞组织。大量激活,上调的发育和分化相关基因可能为这些细胞提供了适应不同环境和药物及其他治疗方法的巨大潜力,甚至可能使它们在不利条件下以静止状态冬眠。根据研究的结果以及研究人员先前对唾液腺ACC的研究结果和研究人员尚未发表的肿瘤组织基因组研究的结果,研究人员坚决认为,大多数肿瘤组织主要依赖于活化的与发育和分化相关的基因及其蛋白,从而使其能够发展成为稳定的侵袭性癌症干细胞,并使其具有针对患者自身免疫和防御反应以及针对药物和其他治疗的适应性。由于大多数发育基因在大多数人体组织中均失活,因此未来的癌症研究应集中于研究与每种癌症类型相关的与发育和分化相关的途径,基因和蛋白质,作为潜在的治疗靶标。因此,可以简单抑制最高的差异过表达的发育相关基因或蛋白质。
|