椎间盘髓核是从发育中的胚胎的脊索中获得的。脊索由被基底膜鞘包围的高度空泡化的细胞组成。外膜鞘对内细胞的渗透性肿胀空泡提供的径向收缩对于驱动胚胎的伸长是必不可少的。随着脊柱的发展，脊索残余物在形成未成熟NP的椎体之间变得分割。在一些脊椎动物如猪，兔，大鼠，小鼠和非软骨营养不良的狗中，假定的脊索起源细胞（脊索细胞[NCs]）在整个生命过程中都保留在NP中。然而，随着人类年龄的增长，大多数NCs让位于较小的，更像软骨细胞的成熟NP细胞。NCs最常见于成熟NP细胞，因为它们具有大尺寸，空泡形态和表型标记物的表达，如Tbrachyury，sonichedgehog，N-cadherin和cytokeratin-8。从NCs到成熟NP细胞的细胞转变与NP细胞外基质（ECM）中与年龄相关的变化一致，例如水和蛋白多糖含量的降低Antoniou等;Pearce，Grimmer，＆Adams，，削弱了组织的静水压力和承受压力的能力。结果，IVD变得更容易发生椎间盘退变，导致腰痛。
　　 因为NP的细胞负责功能性ECM的合成，所以观察到随着衰老观察到的细胞转变涉及椎间盘退变的进展。为了支持这一理论，已将NCs作为NP组织再生的细胞来源。使用来自猪和犬IVD的NP的细胞作为NC的模型，NC分泌物能够刺激成熟NP细胞中的蛋白多糖合成等，并且驱动人间充质干细胞向NP样表型分化。对NCs维持所涉及因素的更好理解可以为预防和治疗椎间盘退变提供有用的见解。
　　 NC是共表达细胞角蛋白和波形蛋白中间丝的罕见细胞类型之一。相反，成熟的NP细胞倾向于仅表达波形蛋白。波形蛋白由波形蛋白单体组成，细胞角蛋白IF由酸性I型细胞角蛋白和碱性II型细胞角蛋白异二聚体组成。专注于对细胞角蛋白特异性的细胞角蛋白，细胞角蛋白和通常一起二聚化，而细胞角蛋白-19被认为能够替代细胞角蛋白。个体而言，波形蛋白和细胞角蛋白IFs已被证明与细胞僵硬有关，粘连，以及对机械刺激的反应。它们还与液泡，囊泡和颗粒的稳定和运输有关;Truchan，Cockburn，May，VieBrock和Carlyon;Uttam等。在NCs中，观察到IFs围绕着空泡，这表明它具有结构上的支持作用。然而，波形蛋白和细胞角蛋白IFs在单独或串联的空泡形态的NC中的参与是未知的。
　　 成熟NP细胞中细胞角蛋白表达和空泡的伴随丧失促使研究人员研究细胞角蛋白IFs，特别是含有细胞角蛋白-8蛋白的细胞角蛋白IFs和空泡形成的NC之间的潜在关系。使用人脊索瘤细胞系作为NC的模型，研究人员检查了与液泡相关的细胞骨架的组织以及化学破坏IF，F-肌动蛋白和微管对空泡化细胞形态的影响。然后研究人员专注于细胞角蛋白-8和波形蛋白IF及其在空泡存在中的个体作用，利用小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰（RNAi）来敲低细胞角蛋白-8和波形蛋白的表达。
　　 为了更好地理解细胞骨架和脊索瘤细胞的细胞溶质空泡之间的结构关系，相对于液泡位置检查了F-肌动蛋白，微管，波形蛋白和细胞角蛋白-8IF的定位。与源自非软骨营养不良型犬的脊索细胞（NCs）类似，研究人员证实钙黄绿素AM荧光始终被排除在脊索瘤细胞液泡之外，通过比较明场和荧光图像可以清楚地看出这一点。因此，研究人员使用钙黄绿素AM排除作为识别所有后续荧光标记程序中的空泡的手段。钙黄绿素AM和相同的细胞的标记的细胞骨架蛋白的荧光可视化显示，只有细胞角蛋白8的IF立即组织周围液泡。对于波形蛋白IF，F-肌动蛋白或微管，未观察到这种围液柱关系。
　　 海外医疗网为了阐明细胞骨架和脊索瘤细胞胞浆液泡之间任何潜在的结构关系，研究人员量化了IF，F-肌动蛋白和微管化学破坏前后的液泡数量。对于这些细胞，波形蛋白和细胞角蛋白IF成功地被40mM丙烯酰胺，F-actin通过1uM细胞松弛素-D和微管通过5uM诺考达唑破坏，没有细胞活力损失，通过活死染色评估。与丙烯酰胺处理细胞，细胞松弛素-d，诺考达唑和所有导致它们各自的结构。在化学破坏之前和之后相同细胞的明视场图像显示处理组中细胞空泡化的不同程度的变化。在这些前和后的图像液泡的定量揭示显著减少（p?在每个小区簇液泡数目对于所有治疗组<0.001），而对照细胞没有明显影响。然而，丙烯酰胺处理对液泡损失影响最大中，细胞松弛素比-d的任一效果或诺考达唑（显著较大p?<0.001）。丙烯酰胺和细胞松弛素-D处理的细胞均显示出比对照细胞显着更高的空泡丢失百分比（p?<0.001）。除了在液泡的数量的减少显著，与丙烯酰胺的IF中断似乎影响液泡形态，其中观察到剩余的液泡为大于对照细胞的少圆形所示。在细胞松弛素-D-或诺考达唑处理的细胞中未观察到对液泡形态的这种定性作用。
　　 用靶向VIM（siVIM）和KRT8（siKRT8）的siRNA转染的脊索瘤细胞表现出它们各自的波形蛋白和细胞角蛋白表达的显着降低。与用阴性对照siRNA（siNEG）转染的细胞相比，siVIM转染的细胞表现出波形蛋白减少41％，而siKRT8转染的细胞表现出细胞角蛋白-8减少26％，如Western印迹分析所示。除了细胞角蛋白-8的表达降低之外，siKRT8转染的细胞表现出几乎相等的波形蛋白降低。对于siVIM转染的细胞，相反的脱靶效应不那么显着，其仅表现出细胞角蛋白-8（~2％）的轻微降低。在siVIM-和siKRT8转染的细胞的波形蛋白和细胞角蛋白-8蛋白所观察到的下降通过免疫荧光中。通过qRT-PCR评估表明，siVIM-和siKRT8转染的细胞具有在它们各自的VIM和KRT8表达式。奇怪的是，研究人员发现与Western印迹分析数据相反，qRT-PCR表明在siVIM和siKRT8转染的细胞中非靶向IF的基因表达增加。
　　 为了确定是否波形蛋白和细胞角蛋白8的IF每个在支持在脊索瘤细胞液泡存在的功能性作用，研究人员比较液泡与siVIM，siKRT8处理的培养物的数量，并且siNEG。钙黄绿素AM的荧光图像的分析表明，siKRT8细胞显著具有（p?<0.001）每个细胞更少液泡相比siVIM和siNEG细胞中。siVIM和siNEG细胞之间没有显着差异（p?=0.081）。?与siVIM和siNEG细胞相比，siKRT8细胞每个细胞的液泡数分布也显着（p<0.001）不同。与siKRT8细胞相比，siKRT8细胞更常见于每个细胞0-1个液泡，siVIM和siNEG细胞更频繁地每个细胞具有三个以上的空泡。胞质空泡中siKRT8细胞减少并不显著改变NC标记T，SHH，和CDH2。这些区分的脊索基因的表达在siVIM细胞中也没有改变。
　　 该研究的结果表明，IFs在支持脊索瘤细胞中的细胞溶质空泡方面比微丝和微管发挥更大的作用。进一步解析不同类型的IF的特定参与表明细胞角蛋白-8在空泡化中起作用，而波形蛋白不起作用。研究人员目前的研究结果与之前观察到的与NP相关的细胞中观察到的与年龄相关的形态学和重合的表型细胞骨架变化是一致的。未成熟NP中的NC的特征在于它们的空泡形态和细胞角蛋白和波形蛋白IF的共表达，而成人NP中较小的，更多的软骨细胞样细胞不是空泡化的，通常只表达波形蛋白IFs。这种细胞转变与NP组成的不利变化相吻合，例如蛋白多糖和水含量降低。这种组成变化损害NP的，以产生和维持流体静压力，并增加体外诊断易感性椎间盘退变的能力。由于它们与更健康的NP相关联，因此更好地了解NC人群至关重要。
　　 虽然细胞溶质空泡的形成是NC分化的一个决定性特征，但成熟的哺乳动物NC中这些液泡的含量和功能尚未最终确定。在开发非洲爪蟾和斑马鱼胚胎时，已经发现脊索体腔轴的伸长需要脊索空泡，并且在脊柱形态发生中发挥积极作用，可能用于产生用于加强脊索的膨胀。已显示细胞-基质相互作用和细胞运动模式对于脊索空泡化过程至关重要。最近，已经表明溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）可以在斑马鱼NCs的液泡膜上发现，并且H+-ATPase是液泡完整性所必需的;然而，液泡腔本身并不是酸性的。总之，这些观察结果表明，脊索空泡是独特的溶酶体相关细胞器，不同于已经表征过的其他细胞器。有趣的是，除了酸化之外，唯一使用H+-ATPase的液泡细胞器是收缩性液泡，用于渗透调节和液体分离，在原生生物中;Stock，Gr?nlien，Allen，＆Naitoh。尽管胚胎NCs的空泡对于发育是必需的，但是在发达的IVD和脊索瘤中保持空泡形态的细胞的重要性尚不清楚，但仍然是特别感兴趣的领域。唯一一项探索成熟NCs空泡功能的研究提出液泡是含有低渗透压溶液的渗透反应性细胞器，可用于调节低渗应激下的细胞体积。与它们在胚胎NCs中的作用相似，完全发育的NP内的液泡可能起到某种机械生物学功能的作用。无论具体功能是什么，已知NP细胞中空泡化的丧失与组织中与年龄相关的变化有关，并且成熟IVD中空泡化NC群体的保存可能对组织稳态具有积极影响。
　　 以前的研究表明细胞骨架在液泡和液泡状结构（如囊泡和颗粒）的形成，定位，运输和结构稳定中起作用。然而，IFs在支持NCs空泡中的作用尚未得到彻底研究。为了研究这种关系，研究人员使用人类脊索瘤细胞系（MUG-Chor1）作为NC的模型。此细胞系先前已被证明可表达NC表型基因，具有空泡形态，共表达波形蛋白和细胞角蛋白IFs。研究人员在脊索瘤细胞中观察到的细胞角蛋白-8IF的周围磁性网络表明它们在结构上参与维持NC的特征性空泡形态。这一发现与先前对hagfish脊索的研究是一致的，其中观察到IFs围绕液泡组织。与先前对犬NC的研究相反，研究人员没有观察到液泡周围的F-肌动蛋白网络。研究人员也没有观察到微管或波形蛋白IF网络包围空泡。
　　 为了进一步阐明细胞骨架和细胞溶质空泡之间的关系，用靶向IF，F-肌动蛋白和微管的细胞骨架破坏剂处理细胞。由于丙烯酰胺，具有细胞松弛素-D的F-肌动蛋白和具有诺考达唑的微管破坏IF的结果，每个细胞的空泡数量显着减少证实了细胞骨架的参与。由于具有破坏的IF的细胞经历了液泡数量的最大减少，因此IF在支持液泡方面可能比F-肌动蛋白和微管具有更突出的作用。除了具有破坏的IF的细胞中空泡数量的显着减少之外，剩余的空泡出现塌陷并且倾向于比对照更少的圆形。尽管在F-肌动蛋白和微管破坏的细胞中空泡的数量显着减少，但是减少的程度要小得多，并且剩余的空泡似乎保持其圆形形状。因此，具有破坏的F-肌动蛋白和微管的细胞中空泡数量的减少可能是由伴随的变化如细胞形状和大小引起的这些靶向元件的化学破坏的间接影响。由于研究人员尚未分析丙烯酰胺，细胞松弛素-D和诺考达唑的脱靶效应，因此这些药物的应用也可能影响非靶向细胞骨架因子，可能的是，具有被破坏的F-肌动蛋白和微管的细胞中液泡数量的减少是由伴随的变化（例如细胞形状和大小）引起的这些靶向元件的化学破坏的间接影响。由于研究人员尚未分析丙烯酰胺，细胞松弛素-D和诺考达唑的脱靶效应，因此这些药物的应用也可能影响非靶向细胞骨架因子可能的是，具有被破坏的F-肌动蛋白和微管的细胞中液泡数量的减少是由伴随的变化（例如细胞形状和大小）引起的这些靶向元件的化学破坏的间接影响。由于研究人员尚未分析丙烯酰胺，细胞松弛素-D和诺考达唑的脱靶效应，因此这些药物的应用也可能影响非靶向细胞骨架因子。
　　 基于IF破坏对液泡的显着影响，研究人员试图使用siRNA介导的RNAi更具体地靶向含有波形蛋白和细胞角蛋白-8的IF。与研究人员对围绕液泡的细胞角蛋白-8IF的观察结果一致，与对照（siNEG细胞）和波形蛋白表达降低的细胞（siVIM细胞）相比，具有降低的细胞角蛋白-8表达的脊索瘤细胞（siKRT8细胞）表现出每个细胞更少的空泡。因为siKRT8细胞在细胞角蛋白-8和波形蛋白表达中都表现出降低，所以细胞角蛋白和波形蛋白IF的共表达可能参与NC的空泡形态。然而，事实上，siKRT8细胞比siVIM细胞具有显着更少的空泡，仅显示波形蛋白表达降低，表明细胞角蛋白-8IFs在NCs的空泡化中起主导作用。因为已知细胞角蛋白表达和空泡形态在成熟NP细胞中同时消失，用NP成熟和变性观察到的细胞角蛋白表达的降低可能是导致空泡形态丧失的原因。
　　 为了探索细胞角蛋白-8和波形蛋白IFs的共表达如何与空泡形态相关联与NC表型相关，Tbrachyury（T），SonicHedghog（SHH）和N-cadherin（CDH2）的基因表达是如何。在siKRT8和siVIM细胞中检测相对于siNEG细胞。这些基因经常用于区分未成熟的NCs和成熟的NP细胞，因为它们的表达趋于随着衰老而降低。研究人员未发现siKRT8和siVIM细胞中T，SHH和CDH2的表达相对于siNEG细胞有任何变化，表明NC表型基因的表达不依赖于IF蛋白表达。因为发现siKRT8细胞具有减少的胞质空泡，这也表明NC表型基因的表达不依赖于空泡形态。这与之前的研究结果一致，这些研究表明非洲爪蟾的空心化和NC命运规范基本上是分离的。细胞命运和空泡化的独立调节将进一步表明单独减少空泡可能不会引发向成熟NP细胞表型的转变。尽管没有观察到细胞角蛋白敲除对脊索基因表达的直接影响，但是可能需要长期稳定敲除或细胞角蛋白-8的基因缺失以观察NC表型中与年龄相关的变化。
　　 研究人员数据的另一种可能解释是细胞角蛋白-8IFs是液泡形成所必需的。与未处理的对照细胞相比，使用Lipofectamine2000转染研究人员的阴性对照siNEG的细胞在一周的亚汇合培养后似乎含有更多的空泡。在未经治疗的脊索瘤细胞中，研究人员观察到培养物达到汇合后液泡数量的类似增加。如果通过转染增强空泡化，则与siVIM和siNEG细胞相比，在siKRT8细胞中观察到的空泡数量减少可能是抑制空泡形成的结果。因为用RNAi敲低IFs（与化学破坏相反）是一个渐进的过程，研究人员无法在IF蛋白敲低之前和之后检查相同的细胞，因此无法确定特定细胞-细胞簇的空泡数量的变化。因此，尚不清楚在细胞角蛋白-8表达降低的细胞中是否丢失了更多的空泡或更少的空泡。未来关于细胞角蛋白-8参与胚胎NC命运决定和脊索形态发生的研究将更清楚地描述细胞角蛋白-8如何参与空泡形成。
　　 据研究人员所知，这是第一项揭示细胞角蛋白IF参与NC样细胞空泡形态的研究。虽然需要进一步的研究来阐明其机制，但研究人员的研究结果表明细胞角蛋白-8如果对未成熟NP中NCs的空泡化至关重要，并且与之前观察到的伴随的成熟NP细胞中细胞角蛋白表达和空泡的丧失一致。对NCs的形态和表型的见解可用于保存这种细胞类型，因为NC已显示出作为NP再生的细胞来源的前景。