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脊索瘤光动力疗法 |
脊索瘤是一种罕见的恶性肿瘤,每年发生0.08-0.5/100.000人。推测该实体起源于骨中的not骨和pre骨和颅底区域。由于浸润性生长和晚期诊断,旨在保留神经血管结构的外科治疗具有挑战性。黄金治疗标准包括积极切除和辅助粒子束辐射。成功的全切除术通常是不可能的,并且手术边缘阴性的患者中有70%会复发。由于当前化学疗法和常规放射疗法的效果差,迫切需要新的辅助治疗方式。
在神经胶质瘤中,基于5-ALA的术中光诊断和PDT代表了这种新颖的方式。外源性5-ALA会导致胶质瘤细胞中PPIX的积累,从而在荧光引导的手术中暴露于波长为400nm的光时,可以在术中鉴定肿瘤。因此扩大切除范围,为患者提供生存益处。当暴露在635nm波长的光下时,PPIX可以作为PDT的有效光敏剂。它的激发引发光化学反应,产生高活性氧,从而杀死肿瘤细胞。早期的临床报道表明对神经胶质瘤患者的生存有有益的作用。基于5-ALA的术中光诊断和PDT在脑膜瘤和垂体腺瘤中也可能有效。然而,目前尚不清楚人脊索瘤细胞是否在接受5-ALA后会积聚PPIX并对PDT敏感。因此,研究人员研究了PPIX的积累以及基于5-ALA的PDT对人脊索瘤细胞系U-CH2的影响。
人脊索瘤细胞系U-CH2购自德国莱布尼茨研究所微生物和细胞培养物收藏中心。当细胞达到90-100%汇合时,将其收获并重新培养。
将U-CH2细胞以1×105细胞/ml的浓度重新悬浮在培养基中。随后,将它们与10、20、30、40或50ug/ml5-ALA孵育4小时或6小时。接着,用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞,并在CyAnTM流式细胞仪上通过流式细胞术检测PPIX的积累。使用405nm的波长进行激发。没有5-ALA的培养物用作阴性对照。将细胞重悬于无色培养基中,以30.000个细胞或15.000个细胞铺板在黑色96孔板中,并在37°C和5%CO2持续14h。加入5-ALA分级剂量,并调整最终体积以获得相等体积。在37°C和5%CO2下孵育6小时后,使用二极管激光器和带有扩散透镜的玻璃纤维探针将细胞暴露于635nm波长的激光下。玻璃纤维探针和96孔板之间的距离固定为93mm。因此,强度为30达到mW/cm2。曝光时间设置为625s,导致总剂量为18.75J/cm2。这些参数符合研究人员研究所用于神经胶质瘤,脑膜瘤和垂体腺瘤的标准方案。阴性对照是仅用50ug/ml5-ALA处理的细胞,仅暴露于激光的细胞或未处理的细胞。
根据制造商的说明,使用WST-1测定法,将细胞暴露于激光后24小时,测量细胞活力。这个原理酶测定是只有代谢活性细胞能够切割浅红色四唑鎓盐,以暗红色的甲臜在水平呼吸链的线粒体。可以通过光谱法定量转化的深红色甲spec的量,该量与活细胞的量成比例。简而言之,添加15ul/孔的WST-1试剂并将细胞孵育30分钟在37°C和5%CO。使用ELISA读数器在450nm波长下进行光度评估。与未处理的孔相比,设置了实验孔的消光。减去仅充满培养基的孔的消光以排除背景吸收。使用GraphPadPrism分析数据。为了进行数据比较,使用了双向ANOVA,Bonferroni的事后多重比较测试和Mann-Whitney-U测试。
随后,通过流式细胞术测量PPIX荧光。所有实验的PPIX平均荧光强度汇总。U-CH2细胞剂量依赖性地积累PPIX。PPIX荧光是显著更高,当细胞用5-ALA温育6相比4小时,在更高的5-ALA浓度。
将U-CH2细胞与梯度剂量的5-ALA在高或低细胞密度下孵育6小时,然后暴露于635nm波长的激光下。在37℃和5%CO2下进一步细胞培养24小时后,评估细胞的生存力。对于两种细胞密度,都观察到5-ALA剂量依赖性的生存力下降。相比15.000个细胞活力为在更高的5-ALA浓度显著下,当30.000个细胞进行处理。LD50为30.25ug/ml的5-ALA。当针对PPIX积累绘制细胞存活率时,观察到负线性相关性。
实验的主要发现可以总结如下:经受外源性5-ALA作用的U-CH2脊索瘤细胞在时间和剂量上均依赖于PPIX积累,这使得细胞对随后的PDT诱导的细胞死亡敏感。正如在许多其他肿瘤实体中观察到的一样,例如在神经胶质瘤,脑膜瘤,儿童脑瘤和转移瘤中,脊索瘤细胞在外源应用5-ALA后显示出PPIX水平升高。据海外医疗网研究人员所知,这是首次报道脊索瘤细胞中5-ALA摄取和PPIX积累。5-ALA的摄取和随后PPIX在肿瘤中的积累是由于肿瘤细胞中涉及转运蛋白,酶和线粒体代谢的多种变化。对于脊索瘤细胞,PPIX累积的负责机制目前未知。在神经外科中,使用荧光引导手术切除神经胶质瘤已成为常规做法。在一项大型的III期研究中报道了在神经胶质瘤手术中使用5-ALA可以实现更高的完全切除率和更长的无进展生存期。从那时起,荧光引导手术也被描述用于脑膜瘤和某些其他脑肿瘤。如果脊索瘤也适合于荧光引导手术,这将是一个巨大的优势,因为它们的特征是破坏性和浸润性生长以及高复发率。另一个非常重要的发现是基于5-ALA的PDT杀死了U-CH2细胞。LD50与胶质母细胞瘤细胞报道的范围相似,对此有临床疗效的早期证据。
如果在其他细胞系中证实了这些初步的体外观察结果,则基于5-ALA的PDT对于脊索瘤的辅助治疗可能变得有趣。与许多其他实体瘤相比,脊索瘤显示出典型的所谓的physaliferous细胞,这些细胞富含透明的液泡。这可能允许更深的激光穿透并增加PDT的治疗潜力。基于5-ALA的PDT和PPIX积累后的存活率之间存在线性负相关,这表明细胞的敏感性主要取决于其PPIX积累的水平,即5-ALA代谢为PPIX和PPIX的流出。然而例如对活性氧的抵抗力的差异,光敏剂在细胞内的定位以及细胞内氧的利用率的差异也可能影响对基于5-ALA的PDT的敏感性。此外,在更高的细胞密度下,细胞似乎对基于5-ALA的PDT更加敏感。这可能提示脊索瘤中细胞间的高水平通讯。实际上,细胞与细胞之间的接触可将细胞死亡扩展至没有积累PPIX或未被旁观者效应通过激光到达的细胞。
最后,与胶质母细胞瘤相比,脊索瘤细胞似乎需要更长的6h与5-ALA的6h孵育时间,而胶质母细胞瘤通常需要3–4h的孵育时间。这是一种仅限于U-CH2细胞的现象还是脊索瘤细胞的典型现象,需要进一步研究。研究人员的实验首次显示了人U-CH2脊索瘤细胞系中5-ALA的摄取和PPIX的积累。此外,该研究表明脊索瘤细胞被光动力疗法破坏。这对这些难以治疗和耐药的肿瘤具有光动力学诊断和治疗的潜力。需要进一步研究不同的细胞系和原发性脊索瘤细胞,以证实这些结果。
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