脊索瘤是一种罕见的骨肿瘤，其起源于胚胎脊索的细胞残余物的恶性转化，具有高度复发性，侵略性和局部侵袭性，并且最常见于cc尾骨和颅底。肿瘤主要影响老年男性成年人。迄今为止，手术切除是脊索瘤治疗的首选，脊索瘤对化学疗法和放射疗法具有很高的抵抗力。但是，手术治疗后仍然经常发生局部复发和最终转移。因此，有关脊索瘤发展的分子生物学过程的知识将有助于海外医疗网研究人员更好地了解这种疾病并开发有效的靶向疗法。
　　 根据基因组数据，人类转录组主要由非编码RNA组成，它们被定义为内源性调节RNA，并根据大小大致分为短ncRNA和长ncRNA。最近显示 LncRNA在与人类疾病相关的生物学功能中起关键作用。微小RNA，这通常是20-30个核苷酸的短的非编码RNA序列，也可作为肿瘤抑制以及癌基因调节涉及许多癌症类型，包括脊索瘤转录后基因表达。发现LncRNA与miRs相互作用，因为它在各种病理机制中与内源RNA竞争。例如，LncRNA H19有助于抑制miR let-7表达的肌肉细胞中的葡萄糖代谢。 LncRNA-p21可通过竞争性结合miR-181b在肝纤维化中增强PTEN表达。
　　 LncRNA loc554202是位于人类9p21.3染色体上的非蛋白质编码基因，最近有报道称它在大肠癌中下调，但在乳腺癌细胞中过表达，提示LOC554202可能起抗癌基因或癌基因的作用与这类癌症中的蛋白质编码基因相似。有研究表明，LOC554202是miR-31的宿主基因并调节其转录水平，在三阴乳腺癌为进一步验证。在脊索瘤中miR-31明显下调，并且其过表达通过诱导凋亡抑制了脊索瘤癌细胞的增殖， miR-31可能与脊索瘤的进展密切相关。这些结果进一步促使研究人员研究脊索瘤中LOC554202的生物学功能以及LOC554202与miR-31之间的关系。在本研究中，研究人员检查了脊索瘤组织中LOC554202和miR‐31的表达，并在脊索瘤细胞系中进行了功能丧失和功能获得实验，并评估了其增殖，迁移，侵袭和凋亡。研究人员还阐明了LOC554202和miR-31之间关系的潜在分子机制，这将有助于研究人员找到治疗脊索瘤患者的潜在治疗靶标。
　　 从医院经手术切除脊索瘤的患者中获得了共20对新鲜脊索瘤和正常组织标本。在手术切除肿瘤病灶之前，没有一个患者接受过任何化学疗法或放射疗法。在参加这项研究之前，每位患者都签署了书面知情同意书。脊索瘤细胞系U-CH1和JHC7从美国典型培养物保藏中心获得。有10％FBS和1％青霉素-链霉素的IMDM-RPMI培养基中培养U-CH1细胞。JHC7细胞在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中生长。将这两个细胞系维持在37°C的5％CO 2增湿的潮湿环境中。为了构建LOC554202和RNF144B敲低细胞模型，分别用针对LOC554202和RNF144B的siRNA转染U-CH1和JHC7细胞，以分别生成U-CH1 / siLOC554202，U-CH1 / siRNF144B，JHC7 / siLOC554202和JHC7 / siRNF144B。对于miR-31的过表达，用miR-31模拟物转染U-CH1和JHC7细胞，并以阴性对照作为对照。所有转染均根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000进行。该研究中使用的所有siRNA和miR-31模拟物均由GenePharma Company合成。
　　 根据制造商的规程，使用TRIZOL试剂从组织和细胞中提取总RNA。对于qRT-PCR，使用逆转录试剂盒将1ug总RNA反转录为cDNA。使用快速实时PCR 7500系统确定基因表达。将PCR反应设置为在50℃下2分钟，随后在95℃下进行40个循环15秒，然后在60℃下进行1分钟。GAPDH被扩增为LOC554202和mRNA的内部对照。U6 snRNA用于标准化miR-31的相对丰度。如前所述计算LOC554202，mRNA和miR-31的表达水平。U6和18S用作细胞质和核阳性对照。将肿瘤组织的冷冻切片短暂融化，在冰中用0.5％TX的PBS透化8分钟，在室温下固定在4％甲醛/ 5％乙酸/0.14 M NaCl中18分钟，在PBS中洗涤，在70℃下脱水％-100％乙醇系列，并根据制造商的规程风干以与MIR31HG探针杂交。用中性胶将盖玻片固定在载玻片上，并用FV10i共聚焦显微镜观察。为了测量细胞增殖率，使用所述电池光的EdU阿波罗进行的EdU掺入实验488体外成像套件根据制造商的协议。简而言之，将细胞用miR-31模拟物，siLOC554202，siRNF144B或NC转染48小时，然后与50uMEdU标记培养基在37°C下孵育2小时。然后将细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，并与甘氨酸孵育。大约5分钟后，将细胞用PBS洗涤3次，并在黑暗中于37°C用200uL1x Apollo溶液染色30分钟。用0.5％TritonX-100的PBS溶液洗涤5分钟后，使用Cytomics FC 500 MCL通过流式细胞仪检测到EDU阳性细胞的百分比。
　　 为了评估单层菌落的形成，将来自不同组的稳定转染的U-CH1和JHC7细胞以每孔600个细胞的密度接种到六孔板中，并孵育7天。然后将细胞用低聚甲醛固定并用1％的结晶紫染色，如先前报道。使用Image-Pro Plus 6.0软件观察形成的菌落，并在光学显微镜下手动计数。转染后，将细胞在六孔板中培养48小时，然后在室温下与Hoechst 33342孵育10分钟。用0.5％TritonX-100的PBS洗涤后，在荧光显微镜下观察到核形态的变化。使用Transwell小室，按照制造商的说明观察细胞迁移。简而言之，将细胞悬浮在无血清培养基中，并接种到未用BD Matrigel TM基底膜基质包被或包被的上腔室中。将0.6 mL的20％FBS培养基作为化学吸引剂添加到下部Transwell腔室中。温育24小时后，将从上腔室迁移到下腔室的细胞固定在4％多聚甲醛中，并用0.1％结晶紫染色溶液染色。在显微镜下在五个随机视野中计数迁移至底部腔室的细胞数，并计算平均数。将稳定转染的U‐CH1和JHC7细胞皮下注射到由中国科学院上海实验动物中心提供的5周龄雄性NOD-SCID裸鼠中。使用以下公式每7天检查和计算一次肿瘤体积：0.5×长度×宽度。
　　 表达质粒pcDNA3.0-LOC554202和pcDNA3.0-GAPDH首先通过生物素-UTP进行了体外转录标记。将生物素标记的LOC554202和GAPDH与过表达flag-EZH2的HEK293细胞沉淀一起孵育。然后将总共20uL洗涤的高容量抗生蛋白链菌素琼脂糖珠添加到上述混合物中并温育1小时。在盐洗缓冲液中洗涤3次后，将小珠在SDS缓冲液中煮沸。随后，通过抗印迹法通过Western blot检测EZH2蛋白。重组GST-EZH2使用GST-琼脂糖亲和层析纯化。将总共5ug的GST-EZH2蛋白与2ug生物素化的LOC554202和GAPDH在200uL结合缓冲液中孵育1小时。类似地，将20uL洗涤的高容量链霉亲和素琼脂糖珠添加至结合反应并温育30分钟，然后根据上述方法洗涤。所有结合反应和洗涤均在室温下进行。还使用蛋白质印迹法测定了回收的蛋白质。
　　 根据制造商的说明，使用麦格纳RIPRNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒，RNA免疫沉淀用于研究脊索瘤细胞中核糖核蛋白复合物是否包含LOC554202及其潜在的结合蛋白EZH2。进行qRT-PCR以检测共沉淀的RNA，并将总RNA作为输入对照。将含有miR-31结合位点的RNF144B的3'-UTR序列克隆到psiCHECK-2载体中。将293T细胞培养在6孔板中，并用100 ng包含萤火虫荧光素酶的psiCHECK-RNF144B-3'-UTR载体和50 ng miR-31模拟物或阴性对照或突变miR-31模拟物转染。使用Lipofectamine 2000进行转染。转染后24小时，根据制造商的说明，通过将萤火虫发光标准化为海肾发光，进行双荧光素酶报告基因测定以计算相对荧光素酶活性。通过用蛋白酶抑制剂混合物在RIPA缓冲液中裂解细胞来提取总蛋白。使用BCA蛋白质检测试剂盒来测量蛋白质浓度。用10％SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶分离出等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜上。将膜用5％脱脂牛奶在Tris缓冲盐水中封闭，然后与一抗一起孵育，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育。蛋白质信号通过ECL化学发光试剂盒检测，并使用Image J软件进行定量。GAPDH被用作上样对照。使用的一抗对EZH2，RNF144B，细胞角蛋白，E-cadherin。使用免疫组织化学检查EZH2蛋白的组织表达。简短地说，将组织用10％甲醛固定并切成4um厚的切片。然后将它们在二甲苯中脱蜡，并在梯度醇中再水化。洗涤切片，然后在第一抗体于4°C孵育过夜后，使用DAB plus试剂盒进行免疫染色。阴性组包括组织染色低于20％或无染色，而其他组则属于阳性组。
　　 使用qRT-PCR测定法确定LOC554202和miR-31在20种配对的临床脊索瘤和非肿瘤组织中的表达。与匹配的非肿瘤组织相比，脊索瘤组织中LOC554202的mRNA水平显着上调。同时，为了确认脊索瘤患者中LOC554302的表达模式，进行了FISH检测以通过LOC554302-target DNA探针进行检测。结果表明，LOC554302在三名不同患者中呈阳性染色。相反，与配对的非肿瘤组织相比，在肿瘤组织中发现miR-31的表达下调。统计分析进一步表明，LOC554202的转录与miR-31表达呈负相关。为了研究LOC554402和miR-31在脊索瘤中的生物学功能，研究人员选择了两个脊索瘤细胞系U-CH1和JHC7进行功能丧失和功能获得实验。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷流式细胞仪显示，miR-31模拟组的edU阳性细胞百分比达到10.0％，而siLOC554202组的ed％阳性细胞百分比达到7.0％。与U-CH1细胞中的对照组和NC组相同。在JHC7细胞中也发现了相似的结果。此外，集落形成试验表明，抑制LOC554202或miR-31的过表达大大损害了细胞集落形成能力，这由U-CH1和JHC7细胞中越来越少的集落形成所表明。这些数据提供了LOC554202的促生长作用和miR-31的促生长作用的证据。为了确认细胞生长抑制是否是由凋亡引起的，在siLOC554202或miR-31处理的U-CH1和JHC7细胞中进行了Hoechst染色和流式细胞仪分析。与NC处理或对照U-CH1和JHC7细胞相比，在siLOC554202或miR-31模拟物处理过的U-CH1和JHC7细胞中观察到明显更多的细胞核浓缩和碎片化。 CH1和JHC7细胞。总体而言，这些结果表明，敲低LOC554202或miR-31的过度表达可抑制脊索瘤细胞增殖并诱导体外凋亡。
　　 研究人员进一步评估了LOC554202和miR-31对细胞迁移和侵袭的影响，这是恶性进展和转移的关键决定因素。使用Transwell系统，研究人员发现siLOC554202或miR-31模拟转染后，U-CH1和JHC7细胞的迁移和侵袭能力显着降低。然后，研究人员通过qRT-PCR和Western blot分析检测了经典的上皮-间质转化标记的表达，包括细胞角蛋白，E-钙黏着蛋白，N-钙黏着蛋白和波形蛋白。 在LOC554202敲低或miR-31过表达的脊索瘤细胞中，细胞角蛋白和E-钙粘蛋白的mRNA水平显着升高，而N-钙粘蛋白和波形蛋白的mRNA水平显着降低。与qRT-PCR结果一致，在siLOC554202或miR-31模拟转染后，U-CH1和JHC7细胞中EMT标记的蛋白质水平呈现相似趋势。这些结果进一步表明，LOC554202 通过调节脊索瘤细胞的EMT过程改变了细胞迁移和侵袭能力。先前的研究结果表明，在许多癌症中，lncRNA通过与zeste homolog-2增强子结合，在调节肿瘤细胞生长中发挥重要作用。分析了RNA LOC554202和EZH2之间的相互作用下拉和RIP法。EZH2通过纯化的生物素化LOC554202 RNA在用Flag-EZH2表达载体转染的HEK293细胞中特异性回收。在体外观察到纯化的GST-EZH2与生物素化的LOC554202结合。与IgG对照相比，脊索瘤细胞中针对EZH2的抗体对LOC554202 RNA的富集程度更高。总之，这些结果证明了LOC554202和EZH2之间存在直接的相互作用。使用qRT-PCR分析了LOC554202过表达对EZH2和miR-31的影响，这表明LOC554202过表达显着增加了EZH2的相对mRNA水平，并且肿瘤组织也显示出与相对正常组织相比，EZH2的表达更高。miR-31的表达被LOC554202的过表达抑制，但可以被EZH2抑制剂3-deazaneplanocin A恢复。这些数据表明，通过募集EZH2，LOC554202与miR-31表达呈负相关。
　　 TargetScan 6.2和miRanda用于预测miR-31的目标。RNF144B被发现是miR-31靶向的新型致癌基因。检查miR‐31是否直接与RNF144B的3′‐UTR结合，在将psiCHECKTM‐2‐RNF144B‐3′‐UTR与miR‐31模拟物，突变miR‐31，或NC。结果表明，当psiCHECKTM-2-RNF144B-3'UTR与miR-31模拟物共转染时，萤光素酶活性降低，而对于突变miR-31模拟物则不变。此外，研究人员发现RNF144B mRNA的表达在脊索瘤组织中显着上调，这表明它可能是脊索瘤中的一种新型致癌基因。此外，通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析确定，miR-31的过表达降低RNF144B表达 。这些发现进一步支持RNF144B是miR-31的靶标。RNF144B已被证明在脊索瘤中过表达，这是miR-31靶向的。为了进一步研究其在脊索瘤中的作用，在U-CH1和JHC7细胞中进行了功能丧失实验。 在U–CH1细胞中，与siRNF144B组相比，NC组的阳性荧光率显着降低。在JHC7细胞中也观察到了类似的趋势。此外，与NC组或对照组相比，用siRNF144B转染的U-CH1和JHC7细胞中发现的菌落越来越少。研究人员还研究了通过Hoechst染色测定法测量的RNF144B的敲低是否影响细胞凋亡。与U-CH1和JHC7细胞中的NC或对照组相比，siRNF144B组中具有破碎核的细胞数量显着增加。LOC554202的过表达可以恢复所有这些RNF144B诱导的作用。这些结果表明RNF144B在体外脊索瘤中在肿瘤细胞生长中发挥积极作用。
　　 接下来，研究人员研究了RNF144B对脊索瘤细胞迁移和侵袭的影响。Transwell分析的结果表明，抑制RNF144B会降低U-CH1和JHC7细胞的迁移和侵袭。qRT-PCR和Western blot分析表明，siRNF144B处理可增加U-CH1和JHC7细胞中上皮标记物细胞角蛋白和E-钙粘蛋白的表达，并降低间充质标记物N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达。LOC554202的过表达可以恢复所有这些RNF144B诱导的作用。综上所述，这些结果表明RNF144B具有转移促进活性，可能是脊索瘤中的一种新型致癌基因。为了进一步验证，将稳定表达siLOC554202，miR-31模拟物或空载体的肿瘤生成，U-CH1和JHC7细胞上的LOC554202 表达水平皮下注射到小鼠中。在siLOC554202或miR-31模拟物中形成的肿瘤比在空载体或对照组中显着小。此外，与对照组相比，siLOC554202和miR-31模拟组的肿瘤体积显着减少。还确定了敲打LOC554202的荷瘤小鼠在肿瘤组织中EZH2，miR-31和RNF144B的表达。结果证实敲低LOC554202可以降低EZH2水平以恢复miR-31的表达，并伴有EMT表型的抑制，从而导致癌基因RNF144B的功能受到抑制。这些结果表明，LOC554202表达与脊索瘤细胞的体内增殖能力显着相关。
　　 lncRNA和miRs的表达失调经常出现在各种癌症中，它们起着抑癌或致癌基因的作用。先前的研究表明，miR-31的宿主基因LOC554202调节乳腺癌细胞的增殖和迁移。然而，目前，脊索瘤中LOC554202和miR-31之间相互作用的分子基础仍然不清楚。在这里，研究人员旨在研究LOC554202和miR-31的参与及其在脊索瘤中的生物学功能。研究人员的数据显示，与正常组织相比，脊索瘤组织中LOC554202显着上调，同时伴随miR-31表达下降。还观察到，LOC554202的下调抑制了细胞增殖，损害了菌落形成能力，促进了体外细胞凋亡。此外，通过抑制EMT表达，siRNA介导的LOC554202的敲低减少了脊索瘤细胞的细胞迁移和侵袭，这由E-钙粘蛋白的表达升高和N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达降低所揭示。后者表明LOC554202促进乳腺癌和肺癌中的肿瘤发生。此外还通过对脊索瘤细胞进行功能增强实验确定了miR-31的功能。与LOC554202的功能丧失相似，miR-31的过表达抑制细胞增殖，迁移和侵袭，在体外增加凋亡，并在脊索瘤中抑制体内肿瘤的生长。这些结果表明，LOC554202具有致癌作用，而miR-31具有对脊索瘤的抑制作用。
　　 尽管miR‐31是从人类9号染色体上LOC554202的第一个内含子转录而来，但 LOC554202的表达与脊索瘤中miR‐31的表达呈负相关。因此，猜测LOC554202可能对其靶基因有直接影响，或通过与LOC554202特异性相互作用的蛋白质间接起作用。进一步的研究使用RNA下拉和RIP分析法将EZH2确定为LOC554202的靶基因，而荧光素酶报告基因分析法将RNF144B鉴定为miR-31的靶标。EZH2是一种多梳蛋白，已被发现是一种肿瘤启动子，经常参与多种人类癌症，例如前列腺癌和乳腺癌。在LOC554202过表达的条件下，EZH2的表达显着上调。RNF144B，一种E3泛素化连接酶，已被证明对于人类原代巨噬细胞的炎症反应是必需的。尽管尚未完全了解miR-31对RNF144B的下游调节，但显示RNF144B在脊索瘤组织中显着上调，并且其下调减少了细胞增殖，迁移和侵袭，并促进了脊索瘤细胞的细胞凋亡。这些发现表明，LOC554202和miR-31具有不同的靶标，在脊索瘤进展的不同途径中发挥不同的作用。总之，这项研究检查了脊索瘤中LOC554202和miR-31的表达及其生物学功能。此外得出结论，脊索瘤中可能存在新型的信号级联。但是LOC554202功能的复杂性可能超出了研究人员的想象，因此需要进一步分析。