胶质母细胞瘤是最致命的癌症之一 |
胶质母细胞瘤是最致命的癌症之一,尽管进行了最佳治疗,但诊断为胶质母细胞瘤的患者的中位生存期仅为12至15个月,几乎所有恶性神经胶质瘤最终都会复发。新的改良化学疗法可能会改善临床结果,但是,大多数候选药物都不会穿过血脑屏障,因此无法到达肿瘤。形成脑血管腔的大脑微血管内皮细胞表达紧密连接,可有效阻断细胞旁运输,以及一系列多光谱外排泵,可将小分子再循环到循环中。结果,不到2%的潜在小分子药物和几乎没有大分子药物能够进入大脑,这阻碍了神经胶质瘤有效治疗方法的发展。可以封装货物并利用先天运输过程进入大脑的药物输送系统的设计对于实现神经胶质瘤的新治疗方法至关重要。
近年来,新的见解提供了对神经胶质瘤发病机理的分子异常的理解,并强调了基因递送的使用以提供新的神经胶质瘤治疗范例。成功的基因传递可能会重编程神经胶质瘤细胞,从而影响多种途径,包括细胞增殖,细胞存活,侵袭和血管生成。小干扰RNA分子具有抑制神经胶质瘤进展中涉及的序列特异性细胞内蛋白质合成的能力。未修饰的siRNA在血流中迅速被酶降解,具有免疫原性,不容易进入细胞,并且无法有效逃逸内体区室到达胞质溶胶。因此,为了满足未满足的治疗需求,需要使用运载工具来实现寡核苷酸的有效细胞内输送。已使用多种材料来实现有效的siRNA递送,例如基于脂质的,无机的和聚合材料。由于穿越血脑屏障的挑战,传统的基因治疗方法是注射用于将siRNA或DNA分子局部转运到大脑的载体。但是,由于接近大脑所需的手术具有侵入性,并且难以到达经常扩散的肿瘤中的所有细胞,因此局部递送在临床上不太重要。为了有效地进行全身性siRNA输送,药物输送系统必须抵抗血清核酸酶,防止肾脏清除,促进从血管向靶组织的排出,进入靶细胞并诱导细胞内释放。这样的系统将能够治疗脑癌以及许多其他神经系统疾病。使用阳离子聚合物将siRNA封装到纳米颗粒中进行传递可能会促进向大脑的运输。聚合物的正电荷不仅可以使它与阴离子siRNA络合,而且这些纳米粒子还可以使用模拟聚阳离子蛋白的自然转运机制,通过吸附介导的转运促进跨BBB的转运。AMT的概念基于对聚阳离子蛋白鱼精蛋白的观察,该蛋白与BBB内皮细胞表面结合,然后诱导细胞摄取并转运到脑实质中。
可生物降解的聚是有效的纳米载体,可提供有效的DNA传递,以及最近对聚合物进行了新的结构修饰,都显示出在体外siRNA传递的希望。对PBAE进行特殊的聚合物修饰以结合二硫键并使纳米材料具有生物可还原性,可以通过生物材料介导的内在靶向作用,将siRNA优先向体外输送至患者来源的胶质母细胞瘤细胞,而不是健康的神经祖细胞。在当前的工作中,寻求开发在血清中稳定,在细胞内环境中可生物还原的纳米颗粒,并允许其通过BBB转运,从而通过系统性给药将siRNA传递至GBM细胞。聚合物保护系统施用的siRNA免受降解并通过BBB转运的固有能力,对于开辟针对脑癌和其他神经系统疾病的新生物疗法是理想的。为了创建能够转运至大脑的纳米药物,首先在体外血脑屏障中利用了新报道的细胞系评估纳米颗粒的特定特性是否可以克服BBB穿越的主要障碍并使系统施用的siRNA到达胶质母细胞瘤细胞。为了评估跨人BBB的转运,对源自人诱导性多能干细胞的人脑微血管内皮细胞进行了转运研究。来自出国看病服务机构体外研究的领先纳米药物随后经过验证,可以在体内通过BBB传递至恶性脑肿瘤。
用于合成基础单体BR6的化学品均购自Sigma-Aldrich。聚合物合成中使用的其他单体购自AlfaAesar。靶向eGFP的siRNA和用作加扰RNA的阴性对照siRNA购自LifeTechnologies。AllStars人类细胞死亡siRNA购自Qiagen,靶向萤光素酶的siRNA购自OriGene。有关合成程序的完整详细信息,请参见ESI。通过使双二硫化物,三乙胺的溶液反应,合成基础单体2,2'-二硫醚-二基双。按照和带有丙烯酰氯的THF。PBAE是通过两步反应合成的。使用迈克尔加成法作为合成方法,将二丙烯酸酯主链单体BR6聚合为侧链单体4-氨基-1-丁醇。第二步,使用2--氨基)甲醇或1--4-甲基哌嗪将二丙烯酸酯封端的基础聚合物封端。
使用ZS进行动态光散射测量,以确定载有siRNA的纳米颗粒的流体动力学直径和表面电荷。在PBS和含有10%胎牛血清的培养基中进行了DLS测量。此外,在特定时间点在10%FBS介质中进行纳米粒度测量,直到达到终点4h。通过将聚合物和siRNA在25mM乙酸钠中混合10分钟来形成纳米颗粒,以确保聚合物和siRNA分子之间完全自组装。使用浓度为180ug毫升-1的聚合物形成被分析的纳米颗粒制剂siRNA的不同剂量为10、60或120nM。透射电子显微镜也用于检查纳米颗粒的大小和形状。所制备的制剂的聚合物浓度为180ug毫升-1并且siRNA剂量为10nM。将不同的纳米颗粒制剂在PBS中稀释,然后添加到碳涂层的铜TEM网格上并使其干燥,然后进行TEM分析。使用FEITecnai12TWINTEM显微镜进行TEM表征。使用SISMegaviewIII广角CCD相机获取TEM图像。使用ImageJ软件测量获得的TEM显微照片中的纳米粒径。
在凝胶电泳分析中,在聚合物和siRNA之间以1200w/w,200w/w和100w/w的比例形成纳米颗粒,这分别对应于纳米颗粒分别装载了10、60或120nMsiRNA。在测定中,对于所有分析的制剂,siRNA剂量保持恒定在0.0025mg毫升-1。将形成的纳米颗粒在PBS或含有10%血清的培养基中以1:10的比例在37°C下孵育4小时,以检查siRNA负载的包封稳定性,并在含有5%PBS的PBS中长达1小时毫升-谷胱甘肽分析siRNA在模拟胞质溶胶的环境中的释放。在每个时间点,收集20uL样品体积,并以1:5的比例将30%的甘油溶液添加到不同的条件下。随后将样品添加到含有1ug毫升-1溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中,并在100mV下进行电泳20分钟。此后,使用紫外线曝光使凝胶成像。使用NanosightNS500进行纳米颗粒跟踪分析,以确定每个纳米颗粒的纳米颗粒浓度和siRNA载量,每次测量均需在PBS中分两步将纳米颗粒稀释150倍。稀释后在Nanosight软件中每帧可获得20–100个颗粒,每组分析了三个独立的样品,通过NTA测量的纳米颗粒浓度被确定为每体积颗粒,并基于此值和所有剂量的siRNA被发现通过凝胶电泳分析可以观察到被100%包封在纳米颗粒中,每个纳米颗粒的siRNA负载量可以通过代数计算得出,即将已知的siRNA分子浓度除以测量的纳米颗粒浓度。
评估跨孔接种的hBMECs单层的纳米颗粒渗透性。hBMECs是根据方案从BC1人诱导多能干细胞衍生而来的。来自人的hBMECs接种在transwell中以进行渗透性测量。用100/g毫升-1胶原IV和50ug毫升-1纤连蛋白的50/50混合物包被过孔过夜。hBMECs细胞随后以1×106的密度接种渗透性实验前两天每毫升细胞数。将培养基更换为使用不含酚红,10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM/F-12培养基,以减少来自细胞膜的自发荧光程度。使用EVOM2在每个孔中进行跨内皮电阻测量配有一对STX-2筷子电极的伏特计,以验证所有实验中细胞单层的完整性。校正TEER值以控制仅含有培养基的孔,并标准化至膜表面积。将纳米颗粒以180ug毫升-1的聚合物浓度添加到顶端腔室中siRNA剂量为10或60nM。实验中使用的siRNA分子用Cy5进行了荧光标记,从而可以监控纳米颗粒在4小时内的特定时间跨细胞单层转运到基底外侧腔的过程。作为对照,将纳米颗粒添加到转运孔中,在转运孔中用胶原蛋白IV和纤连蛋白预涂膜,但没有细胞单层,以测量通过多孔滤膜的总转运量。跨过hBMEC单层的累积纳米粒子传输被设计为跨空对照插入物传输,并且在特定时间点计算了%传输的纳米粒子。使用Synergy2多模式读取器测量基底外侧腔室中的荧光强度。24孔板具有黑框,只能从特定孔中获得荧光信号。
TEM用于表征体外BBB模型中是否暴露于纳米颗粒的hBMECs单层,以可视化屏障性能,即验证紧密连接并评估纳米颗粒穿越的机制。为了准备用于TEM表征的横截面,首先将含有hBMEC单层的transwells用3.0%的甲醛和1.5%的戊二醛在0.1M的椰油酸酯缓冲液中在室温下固定一小时。用0.1M的藻酸酯缓冲液洗涤15分钟两次,然后在Palade的1%四氧化os中在冰上固定一小时。洗涤在Milli-QH2然后将O施加15分钟,然后使用在0.1M椰油酸酯缓冲液中的1%单宁酸进一步染色30分钟。然后将样品在Kellenberger溶液中孵育过夜,然后在Milli-QH2O中漂洗一次,并在50%乙醇中漂洗一次。以一系列梯度的乙醇进行脱水,然后在嵌入Epon中之前在100%乙醇中洗涤3次。使用LeicaMicrotome的金刚石刀切割超薄切片。使用在120kV下操作的FEITecnai12TWINTEM显微镜进行TEM成像。
为了分析纳米颗粒制剂引起功能性siRNA介导的基因敲低的能力,利用了Allstars人类细胞死亡siRNA,它是靶向细胞存活必不可少的基因的siRNA分子的混合物。使用了包含加扰的siRNA的复制纳米颗粒制剂。为了分析非特异性纳米粒子介导的细胞毒性,将暴露于含有非编码乱序scRNA的纳米粒子引起的细胞死亡与未处理的对照进行了比较。在最初的实验中,检查了负载10、60或120nMsiRNA的纳米颗粒对患者来源的成胶质细胞瘤细胞系GBM612的转染效率,该细胞系更能概括人类疾病。在第二种设置中,包括了如上所述接种了hBMEC的转运孔,在基底外侧隔室中培养了GBM612细胞,以检查通过hBMEC屏障转运的纳米颗粒在GBM细胞中的siRNA敲低。GBM612细胞在单独的板中培养,以避免影响hBMEC单层的性质。在实验开始之前,将具有hBMEC单层的插入物移至装有GBM612细胞的板上,并更换培养基。在这两种方法中,与纳米颗粒的孵育在37°C下进行2小时,然后将带有纳米颗粒的培养基替换为新鲜的培养基。三天后,将GBM612细胞固定并DAPI染色。为了确定由死亡siRNA分子介导的细胞死亡,将GBM612细胞暴露于负载siRNA的纳米颗粒的孔标准化为负载scRNA的对应孔。通过用scRNA处理的细胞将纳米粒子标准化为仅暴露于培养基的细胞,可以揭示毒性。
将每只重约30g的雄性裸露无胸腺小鼠和雄性BALB/c饲养在标准设施中并随意提供食物和水。严格按照NIH关于实验动物的护理和使用的指南进行所有动物研究。所使用的动物实验方案已获得约翰霍普金斯大学的机构动物护理和使用委员会的批准。根据约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会的政策和准则对动物进行处理。对于插管的外科手术植入,使用盐酸氯胺酮将动物麻醉,然后用头皮切口暴露头骨。使用立体定向框架将位置定位在耳前1.5mm和前壁1.34mm。将插管插入该位置,以便将细胞以3.5mm的深度接种到小鼠脑纹状体。首先在套管周围的网孔下方添加胶水以确保其位置,随后用手术缝合线缝合切口。愈合一周后,按照先前报道的手术程序,将5×105GBM1A细胞接种到每只小鼠中。在纳米颗粒施用之前,肿瘤形成进行12天。所有手术程序均使用标准无菌技术进行。
在工程纳米粒子制剂的生物分布和药代动力学研究中,出国看病服务机构使用了用IR荧光染料标记的siRNA。在生物分布研究中,纳米颗粒通过静脉注射给药,还有一个对照组包括未经纳米粒子处理的分析器官自发荧光的作用。给药后24小时,对动物实施安乐死并进行解剖以收集器官以进行表征。使用IVIS和LI-CORPearlImpulse成像仪进行成像,以分析纳米粒子的生物分布。在LivingImage软件中分析获取的IVIS图像,并使用ImageJ分析LI-COR图像。在药代动力学研究中,纳米颗粒通过静脉注射。在特定时间点进行眼眶后抽血。进行LI-COR成像以表征IR标记的纳米颗粒的强度,并使用ImageJ进行分析。使用荧光素钠作为示踪剂检查了纳米颗粒是否影响了血脑屏障的完整性。比较了通过静脉注射纳米颗粒治疗的动物与未使用纳米颗粒作为对照的动物之间的血脑屏障完整性。NP给药后两小时,静脉注射200uL荧光素钠,使其循环1h。然后进行眼眶后抽血,并用PBS灌注动物。此后,收获的大脑和组织匀浆,并在80微克毫升,在的Liberase溶解-1在37°C下放置1h,然后在300rcf下离心5分钟。将收集的血液在4°C下以1500rcf离心15分钟。使用酶标仪Synergy2和Gen5软件分析每只动物的脑组织和血液中的荧光素钠浓度。出国看病服务机构将每只小鼠的组织荧光标准化为血浆荧光。
对于脑肿瘤中的蓄积研究,使用LabelITTracker试剂盒用Cy5荧光标记siRNA,以实现纳米颗粒的定位。通过静脉内,心内或肿瘤内注射来施用纳米颗粒。对动物实施安乐死后向它们灌注4%多聚甲醛,提取大脑并在4%多聚甲醛中固定2h。然后将固定的大脑保存在PBS中的30%蔗糖中,直到它们沉没为止,大约三天后发生。然后将大脑包埋在最佳切割温度化合物中,并储存在-80°C直至使用。使用LeicaCM3050S低温恒温器对大脑进行冷冻切片,并将制备的20um薄切片安装在载玻片上。进行脑横截面的荧光显微镜检查以可视化胶质母细胞瘤细胞和Cy5标记的纳米颗粒表达的GFP信号。GBM细胞的GFP信号用于成像肿瘤区域,而Cy5信号用于成像纳米颗粒。使用配备有ZeissAxiocamMRm相机的ZeissAxioObserverA1显微镜以2.5倍和10倍放大倍数获取荧光显微镜图像。ImageJ用于测量肿瘤体积内的纳米颗粒覆盖率。包括了每只动物的大脑肿瘤体积的图像。在分析siRNA介导的敲除的实验中,进行了IVIS成像以分析来自表达萤光素酶的GBM1A细胞的生物发光信号。每次给药之前和之后,进行IVIS成像,并根据制造商的规程进行D-荧光素萤火虫的腹膜内注射。使用LivingImage软件进行图像分析。首先在纳米颗粒注射之前记录所有动物的生物发光信号的IVIS图像,然后每天记录来自GBM1A细胞的生物发光信号随时间的变化。将靶向萤火虫萤光素荧光素酶的siRNA或阴性对照siRNA负载在纳米颗粒上,以进行光学读数,确定是否成功递送并实现了萤光素酶敲低。
出国看病服务机构检查了全身递送的纳米颗粒是否引起任何毒性。纳米粒子通过静脉注射给药,并与未经任何处理的动物进行比较。为了分析对治疗是否有急性反应,在给药后48小时进行了血液分析。进行了丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶活性测定,这是两个重要的肝指标。在4°C下以1500rcf离心15分钟后收集血清,并根据供应商的协议进行分析以确定ALT和AST活性。治疗后两周,通过对所收获组织的组织病理学检查来分析全身毒性。将组织标本包埋石蜡,切成5um切片,然后用苏木精/曙红染色,然后由病理学家进行盲法评估。所有结果均以平均值±平均值的标准误差表示。所有统计分析均使用Prism软件进行,在所有测试中,p小于0.05被认为具有统计学意义。为了分析工程化纳米粒子的体外经内皮运输,使用单向ANOVA和Tukey的事后检验来比较4小时后的总纳米粒子穿越。为了分析体内生物分布,使用两尾学生t-检验比较纳米颗粒治疗组和对照组之间收获器官的IR强度。用于体内分析BBB完整性,两尾学生t检验用于比较纳米颗粒治疗组和对照组之间的标准化荧光素钠强度。为了在体内研究中分析肿瘤体积内的纳米颗粒覆盖率,单向方差分析用于比较不同的给药途径。为了在第一项体内研究中使用IVIS成像进行光学读数分析,使用双向ANOVA和Dunnett的后期测试来比较通过不同给药途径,不同给药途径注射纳米颗粒的组之间的生物发光信号时间点。用于第二体内的光学读数分析在对每只动物的第2天与第0天进行比较的一项标准化生物发光信号分析中,使用了两尾Student'st检验来比较siRNA纳米颗粒治疗组与scRNA对照组的生物发光信号。为了分析体内的全身毒性,使用了两尾学生t检验,比较了纳米颗粒治疗组和对照组之间血清中的ALT和AST活性。
迄今为止尚未发现使用PBAE成功地将siRNA全身性体内递送至脑肿瘤。在研究中探讨了是否可以设计具有物理特性的纳米颗粒来实现这一目标。PBAE聚合物在其骨架结构中存在酯键,因此在水性条件下可生物降解,其半衰期约为2-6小时。酯键的水解通过降低PBAE聚合物的潜在毒性是有益的。虽然这允许相对较慢的释放,但试图在纳米粒子到达还原性胞质的细胞内环境后立即立即触发siRNA的释放。因此将二硫键结合到PBAE结构中以引发siRNA的细胞内释放并减少潜在的细胞毒性。聚合物R646和R647的聚合物合成,其中主链单体2,2'-二硫代二基双首先与侧链单体4-氨基-1-丁醇聚合。然后将该基础聚合物用2-氨基)乙烷-1-醇或1--4-甲基哌嗪封端以分别形成R646或R647。这两种聚合物结构有望在体外将siRNA通过健康的神经祖细胞递送至患者来源的胶质母细胞瘤细胞。在研究中旨在通过模拟BBB内皮的体外测定工程设计可生物还原的PBAE-siRNA纳米颗粒,以将siRNA体内全身递送至脑肿瘤。
全身给药用于纳米级药物递送系统时达到治疗功效的关键特征是粒径和表面电荷,因为这些生理特性影响循环时间,组织从血流中渗出,组织扩散和细胞摄取。进行了DLS测量,该纳米颗粒由用作纳米载体的聚合物R646或R647组成,可在孵育时封装10,60和120nMsiRNA的纳米颗粒的直径在含有10%血清的培养基中。结果表明,降低的siRNA剂量可降低纳米颗粒的直径,其中制剂R646-10的平均流体动力学直径为57nm。还对四个小时内在多个时间点在含10%血清的培养基中孵育的纳米颗粒进行了DLS测量。此外进行了TEM成像,以验证负载10nMsiRNA的纳米颗粒的粒径测定的DLS结果,使用ImageJ以测量R646-10和R647-10且平均直径为54±2nm的和59±2nm的所述纳米颗粒的直径的TEM图像进行分析,分别在具有良好的协议DLS测量。
进行ζ电势测量以检查纳米颗粒的表面电荷。当在PBS中孵育时,在固定的聚合物浓度下,表面电荷随siRNA负载的增加而降低,这表明带正电荷的纳米粒子是具有最小siRNA的粒子。还在包含10%血清蛋白的培养基中分析了纳米颗粒的表面电荷,在这种情况下,所有纳米颗粒的负ζ电势均约为-8mV,这表明阴离子血清蛋白在纳米颗粒周围聚集。然而,蛋白质组装在4小时内没有引起任何主要的纳米颗粒聚集。当将颗粒在PBS中,含有10%血清的培养基中或在模拟细胞内胞质溶胶的微环境中孵育时,进行凝胶电泳分析以检查纳米颗粒的稳定性。聚合物/siRNA重量/重量比为1200w/w,200w/w和100w/w的纳米颗粒的结果,分别对应于10、60和120nMsiRNA的负载量。在0小时的时间点观察到,在PBS和10%含血清的培养基中,siRNA都完全封装在所有R646和R647纳米颗粒制剂中。当在PBS中孵育一段时间后,大多数siRNA保留在纳米颗粒中,但是对于100w/w制剂,纳米颗粒也开始在2h释放;对于200w/w制剂,纳米颗粒也开始在4h释放,而没有释放对于1200w/w制剂,siRNA确实在4小时内发生。当存在10%的血清时,只有1200w/w的制剂才能在所有时间点完全包封siRNA载量。siRNA的低释放发生在10%的血清中,在4h时200w/wR646纳米颗粒在2h和4h时100w/wR646纳米颗粒。同样,在2h和4h,对于200w/w和100w/wR647制剂,在10%血清中观察到较小的siRNA释放。因此,R646聚合物能够比R647聚合物更好地结合siRNA,因为在200w/w时,R646-siRNA纳米颗粒在2h内没有释放。还将纳米颗粒在5mMGSH中孵育以模拟胞质环境,因此评估了潜在触发的siRNA胞内释放的可能性。所有w/w制剂中的R646和R647纳米颗粒在模拟胞质溶胶的环境中均具有有效的siRNA释放,表明环境触发了释放。
结合起来进行NTA评估纳米粒子的浓度和装入每个粒子的siRNA分子的数量。对于所评估的所有不同的聚合物-siRNA组合物,纳米颗粒浓度大致恒定在7×1010纳米颗粒每毫升。发现封装在每个纳米颗粒中的siRNA分子的数量随制剂中使用的siRNA剂量的增加而近似线性地增加。在一起,出国看病服务机构证明了可以通过调节阳离子聚合物和阴离子siRNA负载之间的质量比来调整大小和电荷。此外,正表面电荷可能会通过吸附介导的机制触发生物屏障的穿越。尽管出国看病服务机构的纳米粒子制剂带正电荷,但在血清存在下孵育时,它们仍显示出良好的稳定性。血清蛋白的存在也可能影响siRNA负载的封装稳定性。通过凝胶电泳,证明需要高比例的siRNA负载以确保高的胶体稳定性,从而防止全身给药时siRNA的解离。另外,由封端基团提供的阳离子电荷也有助于包封效率。在凝胶电泳分析中观察到,与R647相比,聚合物R646具有比R647更有效的siRNA包封,这可能是由于E6端帽单体与E7相比具有额外的仲胺,从而导致与siRNA有效负载的静电相互作用增加。此外,较高的聚合物质量比不会降低细胞内环境中的siRNA释放速率,这是由于聚合物结构中二硫键的存在触发了释放,从而迅速降解了细胞溶胶中的多价阳离子聚合物结构。
为了筛选优化的纳米粒子制剂并了解粒子经内皮运输的机制,使用了模仿BBB内皮的Transwell模型。利用了最近开发的体外BBB模型,其中iPSC衍生的人脑微血管内皮细胞作为单层接种在转运孔中。为确保单层形成在播种前将细胞彻底分散。为了避免非贴壁细胞,细胞接种密度也很关键,在这里接种了1×106包被胶原蛋白IV和纤连蛋白的混合物包被的插入片段上的每毫升细胞数,等待2天以获得良好的单层完整性。iPSC分化的hBMEC单层在BC1iPSC衍生的hBMEC单层的细胞连接中表达TJ蛋白ZO-1,occludin和claudin-5。此外,还证明了hBMECs表达了血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1,葡萄糖转运GLUT-1和外排泵蛋白聚糖蛋白。该蛋白质表达谱复制了BBB内皮的特征。hBMEC单层的路西法黄渗透率约为4×10-7cms-1。荧光素黄渗透率低于1×10-6cms-1的单分子层被认为具有受限的细胞旁运输。分析了负载10或60nMsiRNA的纳米颗粒制剂跨dhBMEC单层实现跨内皮运输的能力。纳米粒子R646-10是通过dhBMEC单层显示出最高传输速率的制剂,在所有评估的时间点上,与其他纳米颗粒制剂相比,其渗透性提高了2到10倍。4小时后,与R646-60和R647-10相比,R646-10的总纳米颗粒穿越量在统计学上更高。
为了探索纳米颗粒吸收和跨单层运输的机制,进行了超微结构TEM表征。在所获得的TEM图像中,观察到相邻内皮细胞之间存在粘附连接。此外,在不同横截面位置,整个dhBMEC单层的纳米颗粒传输。已经吸附到细胞膜上的两个纳米颗粒,并且在它们周围是形成的吞噬小窝以促进摄取。电子显微镜显示的AJ的存在以及出国看病服务机构用于衍生自iPSC的BMEC的测定的TEER值约为500Ωcm2,显示出对BBB内皮细胞特性的良好概括。此外,TEM图像表明工程化的纳米颗粒能够通过水泡机制穿过。这可能是由于纳米颗粒的物理特性,包括聚合物纳米颗粒的阳离子电荷和它们的小尺寸,从而使它们吸附到BBB内皮的带负电荷的表面,从而触发了吸附介导的胞吞作用。使用R646或R647聚合物以及不同剂量的siRNA,针对不同纳米颗粒制剂向患者源性GBM细胞的siRNA递送功效。在测试组中使用了包含细胞死亡-siRNA的纳米颗粒,这是针对细胞存活必不可少的基因的siRNA的混合物,作为对照组,使用了包含乱序siRNA的纳米颗粒。转染了所有纳米颗粒制剂均有效的GBM细胞,在50%至80%的人类胶质母细胞瘤细胞中产生了导致siRNA介导的细胞死亡的基因敲低。除R647-120制剂外,由纳米颗粒提供的混杂siRNA引起的非特异性细胞毒性可以忽略不计。通过使用dhBMEC单层添加体外BBB模型,进一步分析了R646-10和R647-10的GBM细胞敲除情况。在该实验设置中,GBM细胞在基底外侧室中培养,以评估siRNA传递穿过dhBMEC层的纳米颗粒的功效。在跨内皮运输后,R646-10和R647-10均在约50%的GBM细胞中产生了明显的siRNA介导的敲低。
原位胶质母细胞瘤模型,利用人类人类源性GBM细胞植入颅内植入小鼠中,用于评估含siRNA的纳米颗粒。使用原发性胶质母细胞瘤细胞的这种体内模型概括了人类疾病。对于体内研究,GFP+吕克+源自患者的GBM细胞接种,以使脑癌细胞可以通过荧光和生物发光来可视化。在体内测试了在体外BBB模型中表现出最高通透性的纳米颗粒制剂R646-10在原位神经胶质母细胞瘤中检查是否可以向脑肿瘤提供全身性siRNA递送。使用被IR荧光染料标记的siRNA来分析纳米颗粒制剂的生物分布。在24小时后,纳米颗粒在除大脑以外的任何器官中均未聚集,与对照组相比,纳米颗粒治疗的信号显示统计学上更高。观察到的背景信号是由于小鼠饮食中叶绿素的存在引起的自发荧光。进一步分析了静脉内给药后R646-10纳米颗粒制剂的药代动力学。在纳米颗粒配方中使用了IR标记的siRNA,并在特定时间点采集了血液。纳米颗粒的血液清除半衰期约为10分钟。为了分析经静脉注射的纳米颗粒制剂是否会影响血脑屏障的完整性,在1小时后注射了荧光素钠IV并测量了向大脑的外渗。脑中的荧光素信号标准化为血清中的信号。与未经治疗的动物相比,接受静脉注射R646-10纳米颗粒的动物之间大脑中的荧光素水平相似。该结果表明纳米颗粒制剂不影响BBB的完整性。
进行荧光显微术以表征通过Cy5标记的含siRNA的纳米颗粒在脑组织中的分布,所述纳米颗粒通过IV或IC注射全身给药或通过IT注射局部给药。其中GFP信号显示肿瘤区域,而Cy5信号显示含siRNA的纳米颗粒。对照组中未加Cy5标记的局部给药纳米颗粒。在全身性给药后,纳米颗粒能够在脑肿瘤中蓄积。通过以下三种给药方法量化了Cy5标记的纳米颗粒与GFP+肿瘤共定位的程度:IV,IC和IT注射。所有组的肿瘤体积的纳米颗粒覆盖率均高于30%。静脉内给药的纳米颗粒组与IT给药的纳米颗粒组相似。综合起来,对脑肿瘤的生物分布研究和荧光显微镜检查表明,根据体外BBB模型的推断,纳米颗粒在全身给药后可以到达大脑。在某些情况下,全身给药的纳米粒子比局部递送的纳米粒子可以到达脑肿瘤的更大区域,这可能是由于在IT递送的套管附近扩散受限。如在体外实验中观察到的那样,经过工程改造的可生物还原的纳米颗粒可能通过水泡机制通过胞吞作用通过BBB主动转运穿过BBB到达肿瘤。另外,在肿瘤附近的内皮中可能存在异常,这可以改善纳米粒子跨过血脑屏障的转运。例如,增加的血管壁厚度是神经胶质瘤脉管系统的共同特征,导致增加的非选择性跨内皮运输。在神经胶质瘤中,胞质囊泡)的大小和数量增加。
接种的GBM细胞表达萤光素酶,因此R646-10纳米颗粒上装有靶向生物发光表达的siRNA或以scRNA作为对照,以实现体内敲除活性的非侵入性光学生物发光读数。进行了两个单独的体内研究以分析功效。在第一个研究中,通过全身和局部注射方式对纳米颗粒制剂进行比较。与对照组相比,NPM通过所有三种途径传递的siRNA导致GBM细胞中生物发光表达的显着降低。对于所有三种不同的施用途径,生物发光的减少大致相同,这与通过所有三种途径施用的标记纳米颗粒观察到的等效肿瘤覆盖率一致在通过纳米颗粒注射之前和处理后2天,通过IV,IC和IT施用用siRNA处理的动物以及以scRNA作为对照的动物的代表性IVIS图像。且击倒效果最大,因此出国看病服务机构在第二次体内选择了IV给药研究是首选方法,因为它具有最低的侵入性。与scRNA装载相比,发现siRNA装载的R646-10纳米颗粒的荧光素酶信号显着降低。该结果进一步证实了从最初的体内研究发现,全身递送的纳米颗粒能够在接种的患者来源的成胶质细胞瘤细胞中提供显着的敲低。用scRNA处理的动物显示出增加的生物发光,这对应于两天内的肿瘤生长。相比之下,用siRNA-Luc纳米颗粒处理的动物的生物发光水平与对照组相比有所降低。R646-10纳米颗粒制剂可将siRNA全身递送至脑肿瘤,而不会引起全身毒性迹象。ALT和AST与未治疗的对照动物相比,静脉内施用的纳米颗粒治疗48小时后血清中的活性,纳米颗粒制剂未显示出明显的肝毒性风险。施用R646-10纳米颗粒两周后收获的组织用于组织病理学检查,未发现与纳米颗粒治疗相关的任何变化或异常,包括在脑,心脏,肺,肝,脾和肾脏中。所分析的组织的组织病理学的代表性两个与纳米颗粒给药治疗组和未经处理的对照。此外,纳米颗粒的施用并未改变血脑屏障的完整性。在任何动物研究中均未观察到不良副作用。因此,研究中R646-10纳米颗粒制剂可在体内通过BBB安全递送至大脑。综上所述,工程化的可生物还原的聚合物纳米颗粒能够全身性输送至大脑的能力可以为安全有效地siRNA输送开辟新途径,以改善脑癌治疗以及更广泛的潜在神经调节。
在这项研究中,利用体外测定法模拟了大脑微血管内皮,从而获得了知识,以设计出一种生物可还原的聚合物纳米颗粒制剂,该制剂可以使血脑屏障穿越和siRNA体内递送至脑瘤。在体外具有最高生物可还原性的聚纳米颗粒渗透性并提供siRNA介导的对患者来源的胶质母细胞瘤细胞的击倒作用,具有正表面电荷,粒径约57nm,在血清蛋白存在下稳定,并在模仿细胞质的环境中以触发方式有效释放siRNA。使用TEM显示,工程化的可生物还原的纳米颗粒通过转胞吞作用穿过微血管内皮。体外最高的纳米颗粒制剂在源自患者的胶质母细胞瘤的小鼠模型中,在全身静脉内给药后发现转运蛋白进入大脑。此外,纳米颗粒能够以安全的方式敲除原位小鼠模型中人类患者来源的胶质母细胞瘤细胞内的报告基因。综上所述,这项研究证明了基于体外评估的工程纳米药物跨内皮运输到大脑的新领域。经过工程改造的可生物还原的聚合物纳米颗粒能够安全有效地向大脑进行全身递送,从而有可能为基于siRNA的脑癌治疗方法开辟新的途径。
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