在所有类型的肿瘤中，原发性中枢神经系统肿瘤的平均寿命损失排名第一。在儿童中，这些肿瘤是第二最常见的和死亡的主要原因相关的肿瘤疾病。神经胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，尤其是高级别胶质瘤，其中包括世界卫生组织III级胶质瘤和WHOIV级成胶质细胞瘤，它根据2016CNSWHO通过结合表型和分子特征进行分类。未另作说明的GBM不仅是神经胶质瘤的最常见类型，而且也是最具侵袭性的类型，其中位生存时间为12-15个月。神经系统的局部组织浸润和弥漫性浸润是影响死亡率的最重要因素。这些特征与不受控制的细胞生长一起，将低级神经胶质瘤与HGG区别开来，并阻止了它们的完整手术切除。肿瘤细胞与细胞外基质之间的相互作用，以及肿瘤细胞的迁移能力，对于肿瘤的侵袭过程是必不可少的。该过程部分地由蛋白酶驱动，该蛋白酶能够降解ECM和粘附分子。此外，蛋白酶在调节某些生长因子的活性中起着重要作用，这些生长因子有助于肿瘤的发生。CNS组织中含有的蛋白酶的三个主要组，分类根据它们的催化部位作为基质金属蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。这些蛋白酶对于神经胶质瘤侵袭的过程至关重要。因此，抑制这些蛋白酶可能在限制神经胶质瘤细胞侵袭中起作用。
　　 丝氨酸蛋白酶抑制剂2型Kunitz，也称为HGF激活剂2型，是一种跨膜糖蛋白，对多种丝氨酸蛋白酶具有抑制活性，包括分泌的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，例如肝细胞生长因子激活剂和纤溶酶和膜丝氨酸蛋白酶如和的hepsin蛋白裂解酶。HGFA和Matriptase负责将前HGF裂解为HGF，这对于MET受体的激活至关重要。因此，在SPINT2控制HGF/MET信号传导起着重要作用。SPINT2已经发现在多种人类组织中，包括前列腺，胎盘，胰腺和脑的待表达。一些由SPINT2调节的丝氨酸蛋白酶的已经在基质组分和跨膜分子的降解，以及细胞-基质粘附工艺的调制牵连。此外，SPINT2表达的下调已经在多种实体肿瘤，包括前列腺癌，子宫颈癌和髓母细胞瘤观察到的，并要与癌症进展和预后不良相关。的甲基化SPINT2基因启动子似乎是SPINT2表达下调主因。使用TCGA数据库发现，SPINT2在成年GBM中经常被甲基化，与低SPINT2mRNA表达水平相关。考虑到SPINT2在神经胶质瘤发展中的潜在作用，以及它对与神经胶质瘤进展有关的蛋白酶的潜在抑制作用，旨在确定SPINT2在小儿和成人神经胶质瘤中的临床和功能相关性。在这里显示SPINT2表达的缺失是儿童和成人神经胶质瘤中的常见事件，至少部分是通过SPINT2启动子高甲基化引起的。发现SPINT2抑制会增加神经胶质瘤细胞的生长和侵袭，并且SPINT2在MMP2激活中起调节作用。
　　 在回顾性系列福尔马林固定石蜡包埋样本中分析了SPINT2蛋白的表达水平和基因启动子甲基化状态，该样本包括371名成人和77名儿科原发性弥漫性神经胶质瘤。肿瘤组织是从葡萄牙的几家医院和英国的皇家马斯登医院的病理科获得。根据2007年WHO指南WHOIII级，NOS和WHOIV级，NOS，两名独立的病理学家对所有神经胶质瘤样本进行了审查，并将其分为高级别神经胶质瘤，根据2016年的分类。成人脑胶质瘤患者组包括186名男性和143名女性，平均年龄为58岁。并非所有样本都提供儿科患者性别数据，但平均年龄为12岁。292例成人和51例儿科患者用于分析SPINT2蛋白。SPINT2的甲基化状态在180名成人和59名儿科样本。本研究得到当地伦理审查委员会的批准，所有参与研究的样本均与捐赠者分离。
　　 免疫组织化学是在3um厚的切片上进行的，该切片来自包含每个样品代表区域的组织微阵列模块。如前所述检测到SPINT2表达。正常胎盘和阑尾组织用作阳性对照，省略一抗作为阴性对照。根据染色强度将SPINT2染色分为四个评分组：0阴性；1虚弱；2适中；3结实。肿瘤组织与得分0和1呈现被归类为阴性和肿瘤组织带有得分2和3作为阳性染色SPINT2呈现。DNA从FFPE胶质瘤组织如先前所述分离，和从神经胶质瘤细胞系是使用Trizol法提取DNA。根据生产商的说明，使用EZDNA甲基化高尔夫试剂盒，用亚硫酸氢钠处理DNA。对SPINT2基因启动子进行了MSP。使用了两组引物来识别甲基化的-SPINT2MSP-Fw和SPINT2MSP-Rv–和未甲基化的SPINT2USP-Fw和SPINT2USP-Rv–亚硫酸氢盐修饰的DNA的启动子。在20ul的总体积中，对于PCR反应使用了1ulDNA，1x不完全缓冲液，1.5mMMgCl2，200uMdNTP，0.2uM每种引物和1UTaqPlatinum。PCR条件如下：在95°C变性5分钟，然后进行38个循环：在95°C变性45s，在60°C退火45s和在72°C延伸45s。
　　 总共使用了10种已建立的人神经胶质瘤细胞系和一种永生化的正常人星形胶质细胞细胞系。使用的五种成人神经胶质瘤细胞系分别是U87MG，A172和SW1783，GAMG和U251。使用的五种儿科神经胶质瘤细胞系为SF188，KNS42，UW479，Res259和Res186。每种神经胶质瘤细胞系的起源和WHO等级分类。成年和小儿神经胶质瘤细胞系分别维持在Dulbecco改良的Eagle培养基和Dulbecco改良的Eagle培养基：营养混合物F-12中，并辅以10％胎牛血清和1％的青霉素/链霉素混合物，根据国际人类细胞系鉴定参考标准，通过短串联重复序列DNA分型对细胞系进行鉴定。所用的载体由Scholm博士提供。为了构建4/T0-SPINT2质粒，使用包含限制性酶EcoRI和XhoI的识别位点的引物通过RT-PCR产生SPINT2cDNA。SPINT2根据生产商的规程，使用GeneJet凝胶提取试剂盒从2％琼脂糖凝胶中回收cDNA。使用FastDigestEcoRI和XhoI限制性内切酶消化SPINT2编码DNA序列和4/T0质粒。从1％琼脂糖凝胶中回收消化的质粒后，使用T4DNA连接酶将CDS以1：1的比例连接到4/T0质粒的EcoRI和XhoI位点套件，根据制造商的说明。通过Sanger测序证实了构建的质粒4/T0-SPINT2的正确序列。
　　 根据制造商的说明，使用X-tremeGENEHPDNA转染试剂用构建的质粒4/T0-SPINT2和空载体4/T0转染SF188和U87细胞。使用150ug每毫升zeocin选择试剂选择转染的细胞进行稳定转染。作为有效转染细胞选择的控制，还向野生型细胞系中添加了zeocin。使用SPINT2特异性shRNA构建体或空载体作为阴性对照，将UW479细胞用于慢病毒shRNA介导的SPINT2沉默。将慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒共转染到HEK293T细胞中，并在48小时后收集含有病毒颗粒的上清液。使用QuickTiterTM慢病毒定量试剂盒HIVp24ELISA估算病毒滴度，并根据制造商的说明计算感染复数。将病毒颗粒添加到前一天接种的UW479细胞中，并孵育过夜。在病毒孵育后48小时，用3ug/毫升进行嘌呤霉素选择转染细胞，以建立稳定的转染细胞系。
　　 使用试剂从肿瘤样品和细胞系中提取总RNA。使用PhusionRT-PCR试剂盒按照制造商的建议对1000ngRNA进行逆转录。对于半定量PCR，如先前所述扩增cDNA。使用CFX96检测系统和SsoFastEvagreen超级混合物进行RT-qPCR。使用ΔCT或ΔΔCT方法将表达水平标准化为B-肌动蛋白。如前所述制备细胞裂解液。使用标准的12％SDS-PAGE分离40ug蛋白质，并将其转移到硝酸纤维素膜上。使用针对人SPINT2的兔抗体实现了免疫检测。将α-微管蛋白用作上样对照。使用化学发光进行蛋白质检测。将细胞接种在盖玻片上的12孔板中，并于次日用4％多聚甲醛固定。将固定的细胞用PBS1x洗涤，并在Triton-X0.3％/PBS1x中透化。接下来，将细胞用PBS1x中的10％FBS封闭1h，并与在5％FBS/PBS1x中稀释的兔抗人SPINT2抗体一起孵育。温育1小时后，洗涤细胞，并与AlexaFluor488山羊抗兔免疫球蛋白G一起温育1h。使用具有4'6-diamidino-2-phenylindole的vectashield固定介质固定盖玻片。为了评估样品，使用了OlympusBX-61荧光显微镜。
　　 三SPINT2启动子超甲基化的神经胶质瘤细胞系用甲基化剂脱氧胞苷处理使用标准程序。简而言之，将3×105个细胞接种在6孔板中，并在补充有10％FBS和1％Pen-strep的DMEM或DMEM-F12培养基中生长。细胞在72小时内用5uM5-氮杂处理，每24小时更换一次培养基和5-氮杂。作为对照，将细胞系用DMSO处理。治疗后，分别使用MSP和RT-PCR评估SPINT2甲基化状态和mRNA表达。SF188和U87胶质瘤细胞分别用100uM或50uMMMP2抑制剂ARP-100处理。简而言之，将细胞在具有ARP的无血清培养基中培养24小时。在所有实验中，仅以DMSO处理的细胞均用作阴性对照。
　　 MTS和BrDU用于分别评估细胞活力和随时间的增殖。每个稳定转染的细胞系的一式三份一在96孔板中以1×10的密度接种3个细胞/孔对SF188和U87MG和4×103细胞/孔为UW479。饥饿4小时后，在0、24、48和72小时内测量细胞活力和增殖。相对于起始值校准结果。进行菌落形成测定以评估SPINT2调节的细胞的存活能力。将UW479转染的细胞以2×105个细胞/孔的密度一式三份接种在12孔板中。单层细胞达到至少95％汇合后，使用200ul塑料移液器吸头在每个孔的中间划一条垂直通道。接下来，通过相差显微镜在不同时间点拍摄“受伤”区域。如前所述计算的相对迁移距离。
　　 带有或不带有MMP2抑制剂的SF188和U87细胞用于细胞侵袭试验。为此，根据制造商的说明使用了BDBioCoat基质胶侵袭室。用DMEM/DMEM-F12水合膜2小时后，2×104将无血清培养基中的细胞添加到上腔室中，将添加了10％FBS的培养基作为趋化剂添加到下腔室中。温育22小时后，将细胞用4％PFA固定并用PBS洗涤1次。用棉签清除膜顶部的残留细胞，然后将附着在下部过滤器表面的浸润性细胞固定在带有DAPI的Vectashield固定介质中。使用OlympusBX61显微镜拍摄图像，并对所有侵入细胞进行计数。进行条件培养基的收集和酶谱以评估MMP2活性。将转染的SF188和U87细胞与无血清培养基一起孵育24小时。收集条件培养基，以13000rpm离心5分钟，通过0.2um孔径的过滤器过滤，并使用丙酮浓缩。将来自每种条件培养基的20ug蛋白用1mg每毫升明胶作为底物进行10％SDS-PAGE。在非变性条件下进行电泳后，使用2％TritonX-100从凝胶中去除SDS残留物，并将酶谱图在37°C的MMP底物缓冲液中孵育16小时，pH7.5）。蛋白水解活性通过使用考马斯亮蓝凝胶染色的对比而可视化。
　　 用于评估总共452种不同组织学的神经胶质瘤组织中SPINT2mRNA的表达。148个星形细胞瘤；228GBM；67例少突胶质细胞瘤，NOS和11例混合神经胶质瘤。还评估了28个正常组织中SPINT2mRNA的表达。同样，癌症基因组图谱数据库用于评估424GBM，NOS患者样本中的SPINT2mRNA和甲基化水平。基于SPINT2的中位数中心强度值对SPINT2阴性和SPINT2阳性的患者样本进行了分类表达式。高于Log2中位数中心强度的值被认为是SPINT2mRNA的高表达，低于Log2则是SPINT2mRNA的低表达。使用从TCGA数据库收集的两个特异性甲基化探针评估了SPINT2基因启动子的甲基化。对于两种探针，强度值大于0.5被认为是高甲基化的，强度值等于或小于0.5未甲基化。还检索了TCGA中可用的临床数据，并将其与SPINT2mRNA表达水平和甲基化状态相关联。Pearsonχ2检验进行了使用SPSS24.0评价的SPINT2蛋白表达之间差异的显着SPINT2与临床特征基因启动子甲基化。使用多元Cox比例风险模型评估SPINT2对神经胶质瘤患者总体生存的影响，与年龄无关。皮尔逊相关性用于评估SPINT2mRNA表达与SPINT2之间的相关性TCGA数据集中的基因启动子甲基化。使用GraphPadPrism软件版本6分别进行了学生t检验和双向ANOVA分析，以比较两个不同条件之间的简单比较，以及在不同条件之间进行多重比较。用于统计学显着性的阈值为p小于0.05，并且所有统计检验是双向的。
　　 为了调查SPINT2蛋白表达在神经胶质瘤中的潜在相关性，出国看病服务机构对345例高级别神经胶质瘤进行了免疫组织化学分析。在302/329胶质瘤病例中发现SPINT2表达缺失。尽管所有年龄段的SPINT2染色均不多见，但在儿童神经胶质瘤中较在成人肿瘤中更普遍。由于小儿肿瘤完全不存在，因此仅在成人神经胶质瘤中才可能进行临床病理分析。SPINT2蛋白染色与年龄，性别，组织学，治疗类型或生存率之间无显着相关性。为了将发现扩展到mRNA，探索SPINT2在两个大型独立神经胶质瘤数据集中的表达。与蛋白质数据相似，与正常脑样本相比，在胶质瘤样本中发现SPINT2mRNA显着下调，而与组织学亚型无关。
　　 由于已经发现SPINT2在实体瘤中，特别是在髓母细胞瘤和神经胶质瘤干细胞中，在表观遗传学上沉默，并且由于在神经胶质瘤样本中观察到明显的SPINT2下调，因此使用了甲基化特异性聚合酶链反应分析以评估儿童和成人神经胶质瘤病例中SPINT2基因启动子甲基化的患病率。首先，使用五种儿科和六种成年神经胶质瘤细胞系来验证SPINT2基因启动子甲基化是否与SPINT2表达相关。SPINT2的超甲基化在所有测试的成年神经胶质瘤细胞系和四个测试的儿科神经胶质瘤细胞系中均观察到了基因启动子中与UW479。上述细胞系SPINT2的mRNA中的表达水平。发现在所有显示基因启动子高甲基化的细胞系中SPINT2表达不存在或表达较低。相反，SPINT2表达在非甲基化的细胞系UW479。此外正常脑组织样品和永生化的正常人星形胶质细胞系显示出更高水平的SPINT2表达。为了确认SPINT2基因启动子的高甲基化与表达之间的关联，用5-Aza处理细胞。处理后的SPINT2甲基化的细胞系部分脱甲基化，导致的重新表达SPINT2的mRNA和蛋白质。接下来，在一组人类神经胶质瘤样品中评估了SPINT2基因启动子甲基化的频率。在测试的61例小儿神经胶质瘤中，发现34例被SPINT2甲基化，而在成人样本中180例中有101例发现是SPINT2。基因启动子高甲基化仅与成人神经胶质瘤，特别是少突胶质细胞瘤NOS的肿瘤组织学在统计学上相关。SPINT2基因启动子高甲基化与临床病理变量之间没有发现其他显着相关性。而且在SPINT2蛋白水平和基因启动子甲基化状态之间没有观察到显着的关联，仅50.8％的缺乏蛋白表达的样品表现出SPINT2基因启动子甲基化。
　　 选择了两种儿科神经胶质瘤细胞系作为模型来实验性控制SPINT2表达水平：展示高水平内源性SPINT2表达和非甲基化SPINT2基因启动子的UW479细胞以及不表达SPINT2和展示SPINT2基因启动子的SF188细胞甲基化过高。此外，成年神经胶质瘤细胞系U87-MG。出国看病服务机构发现使用特定的短发夹RNA，UW479中的内源性SPINT2表达受到抑制。随后选择表达对照shRNA或SPINT2特异性shRNA的稳定细胞系进行进一步实验。发现内源性SPINT2表达的UW479细胞抑制导致细胞活力显著增加和增殖中随着时间的推移，与对照相比细胞。使用集落形成分析观察到稳定的shSPINT2转染的细胞形成的菌落数量增加且生长增加。总之，这些发现支持SPINT2作为神经胶质瘤中的肿瘤抑制因子。为了证实这一假设在SPINT2阴性胶质瘤细胞中诱导了SPINT2表达的恢复。为此，SPINT2在小儿和成年神经胶质瘤细胞中均外源性过表达。成功建立了表达空载体或SPINT2编码序列的稳定转染细胞。与SPINT2沉默相比，小儿SF188和成年U87细胞中外源SPINT2过表达引起相反的作用。SPINT2过度表达细胞表现出降低的活力，增殖和产克隆性质与对照相比SPINT2阴性细胞中。
　　 此前，已SPINT2被证明是细胞外基质-modulating蛋白酶，其涉及在采集的侵入能力的调节器。这些观察结果促使从头开始的伤口愈合迁移和基质胶侵袭试验分析神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭特性。发现内源性SPINT2表达抑制导致伤口闭合显着增加以及侵袭显着增加与表达SPINT2的细胞比较。超表达SPINT2降低显著入侵SF188和U87-MG细胞的数量。神经胶质瘤细胞侵袭和迁移可通过金属蛋白酶调控，特别是MMP2。出国看病服务机构发现内源性表达SPINT2的UW479细胞不表达MMP2，从而妨碍了任何有关MMP2活性的功能测定。SPINT2过表达导致降低的MMP2表达以及以一个降低的MMP2活性通过酶谱分析。同样发现外源性抑制剂的施用导致MMP2活性的降低，以及在细胞侵袭能力。iMMP2与SPINT2过表达的组合导致对MMP2抑制和侵袭的最大作用，表明具有累积作用。考虑对诱导MMP2活性HGF的效果和SPINT2对抑制HGFA和matriptases激活HGF的能力，测试了SPINT2是否可能影响HGF诱导的MMP2活性。出国看病服务机构发现补充HGF确实能够增加MMP2活性，并且仅在SPINT2阴性神经胶质瘤细胞中观察到了这种作用。数据表明SPINT2可能影响MMP2活性，并且胶质瘤细胞中SPINT2表达的恢复可能导致细胞迁移和侵袭能力通过MMP2下调而降低。
　　 恶性神经胶质瘤的浸润性使其几乎无法进行手术切除，导致患者的预后不良。胞外蛋白酶的降解ECM，并赋予对肿瘤细胞侵袭和存活一个有利的微环境的能力是用于漫胶质瘤恶性性质必需。因此，探索神经胶质瘤中不同ECM蛋白受到SPINT2抑制的调节至关重要。报告一系列神经胶质瘤中SPINT2蛋白表达的评估。据公知的是SPINT2在正常脑组织中表达。相反，发现345个神经胶质瘤患者样本中有88％没有显示SPINT2表达。使用两个大型数据库，即伦勃朗和TCGA，在计算机上的mRNA水平上验证了SPINT2表达下调的频率。使用Oncomine微阵列数据库和TCGA，表明SPINT2在GBMNOS下调基因中位居前1％。与正常胎儿小脑相比，在73.2％的髓母细胞瘤病例中报道了类似的发现。缺位SPINT2在对19个成人HGG的研究中也观察到了mRNA表达，再次与出国看病服务机构的结果一致。因此，在神经胶质瘤中观察到的SPINT2表达的丧失表明SPINT2下调在神经胶质瘤的起始或进展中的重要作用。
　　 SPINT2基因启动子甲基化频繁发生在许多肿瘤类型，并且它是负责其在各种实体瘤，包括HGG下调。出国看病服务机构发现SPINT2表达至少部分受表观遗传控制，不仅在成年人中，而且在儿科神经胶质瘤和细胞系中也是如此。假设半定量MSP结果可能受到已知的神经胶质瘤样本异质性和正常脑细胞污染的影响，从而削弱了启动子高甲基化与蛋白质表达之间的显着相关性。来自TCGA数据库的GBM中的全基因组甲基化研究表明，SPINT2基因启动子甲基化与mRNA表达水平之间存在显着关联。此外，与正常前列腺细胞相比，表观遗传学似乎不能解释SPINT2蛋白在前列腺癌细胞中的表达失调。这种差异可能是由于翻译后修饰导致蛋白质稳定性丧失。成年神经胶质瘤细胞中SPINT2的过表达可能会降低MET的磷酸化以及增殖，集落形成，运动性和形成球的能力。结果表明SPINT2的频率更高下调儿童起源的神经胶质瘤样品中的表达，因此，试图通过调节SPINT2在SF188和UW479细胞中的表达来探索SPINT2在儿童神经胶质瘤细胞中的潜在抑癌作用，并确认以前在成年U87神经胶质瘤细胞中的结果。发现SPINT2表达导致这些细胞中细胞迁移和侵袭能力下降，以及细胞增殖和集落形成能力下降。SPINT2抑制细胞运动性和侵袭的能力也已在其它肿瘤类型观察。另外，已经发现SPINT2的失调不仅与局部有关，而且还与促进细胞脱离的系统性扩散有关。
　　 SPINT2被描述为卵巢癌细胞中MMP2的负调节剂。在神经胶质瘤中，已发现MMP2经常被激活和上调，从而促进与入侵相关的细胞机制。在这里报告SPINT2可能通过MMP2活性抑制充当胶质瘤细胞侵袭的负调节剂。MET的配体HGF通过SPINT2介导转化为活性形式，已发现它能增加神经胶质瘤细胞中MMP2的活性。假设这可能是SPINT2对神经胶质瘤细胞侵袭性调控作用的潜在机制之一。确实发现SPINT2可能会损害HGF对MMP2的刺激作用。SPINT2表达和MMP2抑制对神经胶质瘤细胞侵袭能力降低的累积影响表明其他与侵袭相关的分子还有其他作用。实际上，已发现尿激酶型纤溶酶原激活剂-纤溶酶级联反应，包括已知受SPINT2调节的丝氨酸蛋白酶，是负责proMMP2转化为其活化形式的原因。根据结果出国看病服务机构得出结论，SPINT2在成人和小儿神经胶质瘤中均表现出肿瘤抑制活性。SPINT2基因启动子过度甲基化可能是胶质瘤中SPINT2下调的机制之一。得出结论SPINT2失控可能通过MMP2失控影响神经胶质瘤细胞的侵袭和迁移。