尽管采用现代多模态疗法，恶性神经胶质瘤的预后仍然有限。切除作为多模式设置通常的第一治疗的程度被接受以显著延长患者的总体生存。在神经胶质瘤手术中，正常组织与恶性组织之间的区分通常具有挑战性。因此，术中更有效地识别胶质瘤组织，几个手术助剂已经出现，如术磁共振成像，超声和荧光引导手术。五氨基乙酰丙酸诱导恶性神经胶质瘤组织中荧光原卟啉IX的选择性积累，并用于FGS。这项技术最近已通过美国食品和药物管理局。但是，尚不清楚控制肿瘤细胞中选择性代谢的确切机制，以及在人脑肿瘤组织中积累的确切时间表也不清楚。后一个因素对于确定5-ALA初始给药的最佳时机至关重要。施用5-ALA后的潜伏期太短可能会导致荧光在手术期间尚未达到最大，而过早给予药物可能会由于PpIX清除而导致荧光变差。
　　 从历史上看，在产品特性Gliolan的的摘要推荐给药时间是根据在其中荧光峰中观察到6小时给药后动物实验。因此，建议在麻醉前3小时内口服5-ALA，其余3小时用于诱导麻醉，定位，悬垂，开颅手术和切除中心肿瘤核心。迄今为止，几乎所有的临床试验都采用了3小时制。然而，鉴于该方法的迅速发展，关于动物结果可以简单地包含在人脑肿瘤中的假设仍有待检验。据海外医疗网研究人员所知，尚无针对人类脑肿瘤组织中PpIX荧光时间轴的研究。其他器官系统的信息有限。在先前的报告中，还描述了皮肤手术的血浆PpIX浓度在8小时，分钟后达到峰值，然后在6小时后达到最大值，在40mg每千克剂量后，血浆PpIX浓度在6.5至9.8h范围内。这表明先前假定的脑肿瘤组织中最大荧光的6小时潜伏期可能太短。
　　 此外，人脑肿瘤中肿瘤组织PpIX清除的动力学也是未知的。有关PpIX清除的知识将对手术产生进一步的影响。如果观察到缓慢的清除，则表明窗口更长，其中的荧光可能有助于切除。在实际操作中，有时出于后勤原因而推迟手术时，了解计划外的延迟是否对荧光强度或质量起重要作用非常重要。因此，本研究的目的是研究人脑肿瘤中荧光的时间依赖性，以确定在施用5-ALA后按神经胶质瘤等级和已知荧光质量进行分层的最佳切除时间。由于时间和漂白问题以及不道德的手术延长，在单个患者中进行连续测量以确定患者特定的肿瘤荧光病程似乎并不可行，无法获得有用的数据。相反，研究人员选择了一种启发式方法，即在大量患者中每位患者执行有限的测量，以最终随时间推移在肿瘤中生成PpIX荧光图。所有测量均在精心保护避光的新鲜提取组织中进行。研究人员于2017年12月至2018年5月期间在明斯特大学医院神经外科评估了患有恶性神经胶质瘤可疑病变的患者，该研究由跨学科肿瘤委员会进行手术治疗，与本研究无关。
　　 患者接受5-ALAGliolan;麻醉诱导前3至4小时，口服标准剂量20mg每千克的Medac，这是研究人员服务的宗旨。记录了5-ALA给药的确切时间。使用配备有BLUE400过滤器系统的OPMIPentero900显微镜进行手术，以实现PpIX可视化。在肿瘤切除之前获得冷冻切片，以证实怀疑诊断为恶性神经胶质瘤。当遇到荧光时，要求外科医生按三级标准对组织的荧光质量进行分级。在手术过程中从每位患者中收集多达3份活检样本：在早期时间点，中间时间点和晚期时间点。在提取组织样品后立即在体内确定光谱特征。另外，记录了5-ALA给药和组织活检之间的经过时间。提供所有样品用于神经病理学评估。获得了每个患者的书面知情同意书。在涉及人类参与者的研究中进行的所有程序均符合机构和国家研究委员会的道德标准，并符合1964年的《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案或类似的道德标准。活检的数据收集和科学使用先前已经获得地方伦理委员会的批准。
　　 使用连续的高光谱成像系统进行光谱。实施了一个发光二极管作为光源，并通过液体光导将其集成到OPMIPICO系统中。然后将检测到的光导向科学的互补金属氧化物半导体相机。sCMOS相机具有最小的传感器噪声和高量子效率，被用于荧光的高灵敏度检测以及用于归一化光学组织特性的白光图像。液晶可调滤光片位于消色差透镜和sCMOS相机之间。剩余的光直接对准带有IMX252传感器的彩色相机，用于记录白光图像，可以与荧光图像叠加。在两个分束器之间安装了带有BLUE400观察滤镜的滤镜转环，因此也可以选择记录BLUE400图像。各个组件由LabVIEW控制。使用sCMOS相机，通过从最大波长开始每3nm拍照，记录了LCTF整个波长范围的荧光光谱。对于使用5nm步进的白光光谱，最后使用3nm步进的暗光谱，同样进行了操作。结果是每个像素带有背景信号的荧光光谱和白光光谱。在两个分束器之间安装了带有BLUE400观察滤镜的滤镜转环，因此也可以选择记录BLUE400图像。
　　 研究人员根据活检的体积在每个活检中测量了10至30个感兴趣区域的组织的荧光强度。平均强度以给出每个ROI的最终值。数据通过参考值标准化。使用非漂白参比物进行参比测量，该参比物在卟啉光谱范围内发出荧光，并且在每次组织测量前获得以校正短期波动。如先前报道，使用MATLAB计算组织CPPIX。将荧光光谱使用的白色光光谱和双频带归一化算法标准化纠正不均匀的组织吸收和散射特性。该方法涉及将荧光光谱除以白光谱的红色和蓝色光谱带的乘积，并使用系统特定的，通过实验获得的红色带上的指数。归一化后，每个光谱是其基本组成部分，自发荧光和PpIX荧光的线性组合这一事实被用于建立方程组的线性系统，以求解每个基本光谱的比例。使用最小二乘回归法找到最佳解决方案。因此，对测得的光谱进行了归一化处理，并且未进行光谱混合，剩下了纯正的归一化PpIX光谱。该频谱的大小与相对CPPIX成正比。为了获得绝对值，使用相同的方法使用已知的CPPIX分析了荧光体模，从而对算法进行了校准。将来，研究人员计划化学测量脑肿瘤组织的CPPIX，以验证和更新此绝对校准。根据2016年世界卫生组织分类，对所有肿瘤组织，包括用于活体检查的活检组织进行组织学评估。使用免疫组织化学确定异柠檬酸脱氢酶1突变状态。在所有肿瘤中，对石蜡包埋的材料进行了分子检查，以检测O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因5'区域的甲基化状态。如前所述，通过甲基化特异性聚合酶链反应分析了亚硫酸氢盐处理的DNA。
　　 出于统计目的，研究人员将给药后的时间细分为1小时间隔。将在给定的小时间隔内进行的所有测量平均，得出时间间隔5至6小时，6至7、7至8、8至9和9至10小时。在任何时间点都不会将依赖样本和独立样本混合在一起，以免扭曲数据。使用F检验评估两组之间的分布，并使用Bartlett检验评估经过时间组之间的平均值。Kruskal–Wallis检验用于非参数检验。通过配对t检验分析配对数据。Bonferroni方法用于调整多个比较。如果差错概率P小于5％，则认为差异具有统计学意义。所有的统计分析都是使用EZR进行的，这是R统计计算基金会的图形用户界面。
　　 海外医疗网研究人员纳入了43位男性和25位女性，年龄在23至82岁之间。至于病因，肿瘤被分类为59个IV级神经胶质瘤和9个III级神经胶质瘤。总共收集201份组织样品用于测量FI。当通过光谱学和独立于时间进行评估时，外科医生感知到的荧光质量“强”和“弱”显示出显着不同的FI。在比较WHO的III级和IV级时，研究人员无法观察到FI的统计学差异。估计的CPPIX同样在观察到的荧光质量之间也存在显着差异，在WHO的III级和IV级之间也是如此。在IDH状态，性别，年龄和肿瘤位置之间的比较中，无法发现FI和估计的CPPIX之间存在显着差异。总体而言，在5-ALA给药后7至8小时出现FI高峰。CPPIX在7至8小时后显示出类似的峰。分析组织中口服施用5-ALA和FI后的时间之间的关系，与计算的CPPIX的时间关系。有趣的是，被外科医生感知为“弱”的荧光的峰值晚于被感知为“强”的荧光，即在应用后第九小时内达到峰值。
　　 5-ALA是一种有效的手术辅助工具，可在高级神经胶质瘤切除期间实时识别肿瘤组织，目前已广泛使用。尽管5-ALA已在临床上广泛实施了10年以上，但与5-ALA优先代谢和PpIX在人肿瘤组织中积累有关的确切荧光动力学仍不清楚。因此，最重要的是表征5-ALA诱导的荧光的时间依赖性，并估计何时可以预期手术期间恶性神经胶质瘤的最大FI。在本研究中对FI进行了定量，以证明恶性神经胶质瘤组织中PpIX的荧光动力学。这项非原位研究的时间荧光曲线显示，在施用5-ALA后7至8小时，FI和CPPIX最高。使用原位脑肿瘤模型的早期结果提示PpIX荧光在6小时达到峰值。在人脑肿瘤中观察到的使用外科手术期间收集的样本并在非原位即刻测量的结果表明，这个最大值要晚一些。该观察结果更符合血浆或皮肤中的PpIX峰值。该观察结果对5-ALA给药后的手术时机有影响。现在建议政府不要开始2.5-3.5小时，手术前，作为SPC的Gliolan指定和在关键随机批准的研究测试了，而在较早的时间点。对于单个机构，后勤方面应考虑到最佳应用时间，与患者有关的方面也应考虑到，例如暴露肿瘤或进行定位所花费的时间。
　　 有趣的是，对于胶质母细胞瘤而言，荧光的清除似乎比积累所需的时间要慢，即使在应用后9至10小时，组织荧光仍约为最大值的65％。高于应用后的6至7小时，表明超出了在GBM中10h的测量窗口。此外，主观上被认为具有弱荧光性且主要取自荧光边缘的样品在8至9小时后显示出峰值荧光，强调了较早应用的必要性，因为最后到达的是肿瘤的这一部分，但是其中荧光引导性切除可能起着最重要的作用。已经发现荧光质量分别与肿瘤细胞和Ki-67指数相关。PpIX最大值的知识也将在5-ALA光动力疗法新兴领域的应用时机上发挥作用，其中对肿瘤组织的损害将取决于PpIX的可用性。当比较FI和组织中计算出的浓度时，PpIX的动力学差异可忽略不计。这是幸运的，因为视差将对依赖于观察到的荧光的荧光引导切除的时机产生影响，而PDT将依赖于细胞PpIX的浓度。笼统地说，研究人员的观察强调了任何术中荧光方法的时间依赖性，无论是5-ALA衍生的卟啉还是注射染料通过突破的血脑屏障螯合进入肿瘤并随水肿传播，例如荧光素。
　　 了解FI的时间依赖性至关重要。例如，对于具有最小荧光的肿瘤，对于肿瘤边缘或在具有难以观察的几何形状的肿瘤中，在最佳荧光的时间点进行操作可能很重要。此外，对于高级神经胶质瘤，使用5-ALA卟啉的光动力疗法正在接受审查。此方法的功效还取决于可能的最高PPIX浓度。研究人员对68例患有恶性神经胶质瘤的患者的201个组织进行的分析表明，在施用5-ALA后约7至8小时，甚至在边缘的，弱发荧光的恶性神经胶质瘤组织中，荧光峰值出现。对于5-ALA给药的正确时机，需要考虑此观察，具体取决于手术方法和各个部门的后勤情况。