神经胶质瘤是具有极侵袭性临床表型中枢神经系统的初级神经上皮瘤。尽管在标准治疗，包括最大手术切除，随后伴随和辅助化疗放疗的最新进展，神经胶质瘤的治疗仍然极为不利。因此，开发新策略和发现神经胶质瘤治疗新药至关重要。迄今为止，天然产物一直是化学疗法的主要来源，并为大量候选物提供了有希望的抗肿瘤活性。Xanthatin是一种天然生物活性倍半萜烯内酯，从地上部分中分离出来。菊科天然草药在中国常用。以前的研究表明，表现出xanthatin各种各样的生物活性，包括抗癌，抗血管生成，抗病毒，抗炎，抗真菌，抗菌药，抗锥虫小体和抗胰蛋白酶活性。此外，据报道黄嘌呤素在多种癌细胞培养系统中抑制增殖并诱导凋亡，包括非小细胞肺癌细胞，MKN-45人胃癌细胞，MDA-MB-231人乳腺癌细胞，B16-F10鼠黑素瘤细胞和L1210小鼠白血病细胞。最近使用常规的磁共振成像和动态对比增强MRI动态监测了黄嘌呤在荷胶质瘤小鼠体内的抗肿瘤生长作用。然而，尚无详细研究报道黄嘌呤素对神经胶质瘤细胞凋亡的作用，其抗肿瘤活性的潜在机制尚待阐明。
　　 内质网是负责各种生理过程，包括合成，折叠，并且大多数膜和分泌蛋白和钙存储中的翻译后修饰的一个基本细胞器。内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质的积累导致内质网应激，从而触发细胞保护性信号通路，称为未折叠的蛋白反应，以恢复和维持内质网中的稳态。如果UPR不能纠正ER应力的平衡，细胞凋亡机制可能被触发，最终导致细胞死亡。最近的一些研究已经发现，某些化疗药物通过内质网应激诱导的细胞凋亡导致细胞死亡。胶质瘤细胞处于恒定的低度内质网应激状态，这可能有助于其对治疗方案的抵抗力。因此，ER应激反应可能是开发化学治疗剂诱导神经胶质瘤细胞毒性的可能靶点。因此，在本研究中黄嘌呤素是否可以改变神经胶质瘤细胞和异种移植物中的内质网应激和UPR信号通路，从而导致细胞凋亡和肿瘤生长受阻。
　　 将得自溶解在浓度为10mM的二甲基亚砜中，制成储备溶液，将其储存在零下20度下。替莫唑胺，4-PBA，MTT和DAPI购自Sigma。AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒购自BestBio，Inc。增强的3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐显色试剂盒购自生物公司。原位细胞死亡检测试剂盒购自Promega。血清丙氨酸氨基转移酶，天冬氨酸氨基转移酶，C6大鼠神经胶质瘤细胞系和U251人类神经胶质瘤细胞系获自细胞生物学研究所。将细胞在含有10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中于5％CO2湿润的气氛中于37°C进行培养。将C6和U251细胞用浓度为1至20uM的黄嘌呤素连续处理0至24小时。ER应激抑制剂4-PBA用于在黄嘌呤暴露前处理神经胶质瘤细胞4小时。如先前描述从怀孕的Sprague-Dawley大鼠的E17胚胎制备的原代培养的神经胶质细胞。培养几天后，将细胞暴露于黄嘌呤12或24h，然后进行MTT分析。
　　 根据制造商的说明，使用Lipofectamine2000试剂，用50-100nM同源蛋白siRNA转染C6细胞。用于转染。转染后三十六小时，将细胞用15uM黄嘌呤或0.1％DMSO处理另外12小时，然后进行MTT分析或蛋白质印迹。将C6和U251细胞接种到96孔板中，然后以不同的浓度和暴露时间暴露于黄嘌呤。如先前所述，使用MTT测定法测量细胞活力。下式使用：细胞生长抑制率=×100。为了评估细胞凋亡，使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒根据制造商的说明书，用AnnexinV和PI对C6和U251细胞进行染色，然后使用FACSVerse流式细胞仪进行流式细胞术。使用具有PI染色的流式细胞仪分析细胞周期。在黄嘌呤处理后12小时，一式三份收集C6细胞。用冷PBS洗涤两次后，将细胞重悬于70％乙醇中，并在4°C固定过夜。接下来，用PBS洗涤固定的细胞，并在黑暗中与RNA酶A和PI在37℃下孵育30分钟。然后用FACSVerse流式细胞仪分析细胞周期分布。
　　 如先前所述，将细胞暴露于指定浓度的黄嘌呤，并使用原位细胞死亡检测试剂盒处理以进行凋亡分析。DAPI用于染色细胞核。在每组四个不同部分的五个随机选择的区域中，对TUNEL阳性细胞的数量和细胞核总数进行计数。直方图显示TUNEL阳性细胞相对于总细胞数的比例。从实验动物中心购买雄性BALB/c无胸腺裸鼠，用于建立神经胶质瘤异种移植模型。根据医科大学动物护理和使用委员会的指导进行动物手术。将总共1×106个C6细胞重悬于100uLPBS中，并皮下注射到每只小鼠的右侧腹区域。在注射后约7天，当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分为五组：对照组，黄嘌呤素组和阳性对照组TMZ组。将溶于0.5mLPBS中的黄嘌呤素每天一次腹膜内注射到黄嘌呤组的小鼠中，持续2周，并且每天一次将TMZ腹膜内注射到TMZ组中的小鼠中。对照组的小鼠注射无菌PBS。用游标卡尺在三个维度上测量肿瘤，并每2天称重一次。切除肿瘤组织用于蛋白质印迹和免疫组织化学分析。依照制造商的说明，使用酶标仪收集血样以测量肝功能和肾功能的生化标记。
　　 将肿瘤组织样品在4％多聚甲醛中固定24小时，脱水，包埋在石蜡中，切成5um的厚度。将切片在二甲苯中脱蜡，并用梯度酒精再水化。回收抗原，并用过氧化物酶抑制剂淬灭内源性过氧化物酶活性。接下来，将切片用5％山羊血清封闭1小时，并与相应的一抗在4°C下孵育过夜。然后，将合适的生物素化二抗与该切片在37°C下孵育1小时，然后与辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素在37°C下孵育15分钟。免疫组化染色是在3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐的作用下进行的，时间约为1-3分钟。然后，用苏木精对细胞核进行染色，在梯度乙醇中脱水，在二甲苯中澄清，并在光学显微镜下观察。同样，C6细胞在玻璃盖玻片上生长并用15uM黄嘌呤处理，然后使用抗-4-HNE抗体和抗iNOS抗体。在有或没有黄嘌呤素的情况下将C6细胞培养12小时，然后如先前所述进行免疫荧光染色。细胞核用DAPI染色。在Zeiss810共聚焦扫描显微镜上采集图像。AlexaFluor568偶联的山羊抗兔IgG购自Invitrogen。
　　 在用所示浓度的黄嘌呤处理12小时后，使用TRIzol试剂从U251或C6细胞中提取总RNA，然后逆转录合成cDNA。通过使用SYBRGreenQPCRMasterMix和ABI7500快速实时PCR系统的定量PCR定量所有基因转录物。使用GAPDH作为内部对照，使用方法评估基因转录物的相对表达水平。蛋白质提取和蛋白质印迹分析如先前所述进行。将C6和U251细胞接种在六孔板上，并用不同浓度的黄嘌呤处理不同时间。用冰冷的PBS洗涤细胞，并直接提取到裂解缓冲液中。电泳和转移后，将PVDF膜用TBST缓冲液中的5％脱脂奶粉封闭，然后在4°C下与针对以下蛋白质的一抗孵育过夜：葡萄糖调节蛋白78，CHOP，磷酸化eIF2α，磷酸化IRE1α，X-box结合蛋白1，激活因子4，激活转录因子6，裂解caspase-3，Bcl-2，Bax，微管蛋白和GAPDH。将膜与相应的辣根过氧化物酶结合的次级IgG孵育1小时。使用增强的化学发光试剂盒显影印迹。通过表观分子大小评估特定条带。最后，使用BioshineChemiQ4600仪器捕获图像，并使用ImageJ软件分析所选谱带的强度。定量数据表示为平均值±SEM。使用单向方差分析和邓尼特检验对统计比较进行分析。P小于0.05表示差异显着。
　　 为了确定黄体素对神经胶质瘤细胞存活的影响，通过MTT测定法评估了细胞活力。黄嘌呤酮处理12和24h导致神经胶质瘤细胞生长抑制率呈剂量依赖性。然而，黄嘌呤素对原代培养的大鼠神经胶质细胞的活力影响很小，尤其是在暴露12h后。为了进一步研究黄嘌呤素是否通过诱导细胞周期停滞来抑制神经胶质瘤细胞增殖，使用流式细胞仪测量了用黄嘌呤素处理的C6细胞的细胞周期分布。黄嘌呤对G0/G1期，S期和G2/M期的细胞百分比没有明显影响。这些结果表明黄嘌呤素减少了神经胶质瘤细胞的增殖，但是对细胞周期每个阶段内的细胞百分比没有影响。为了进一步研究黄嘌呤素是否通过诱导细胞凋亡降低细胞存活率，在C6和U251胶质瘤细胞中进行了膜联蛋白V/PI双重染色和流式细胞术。黄嘌呤素增加了早期凋亡中C6细胞的数量，在用20uM黄嘌呤素处理12h后，约43.4％的细胞发生了凋亡。TUNEL分析进一步表明，与媒介物对照组相比，剂量为15和20uM的黄嘌呤素增加了TUNEL阳性细胞的数量。一致地，黄体素治疗以剂量和时间依赖性的方式诱导细胞凋亡，这由caspase-3裂解水平的增加和C6中Bcl-2/Bax比率的降低所证明和U251细胞。这些结果表明黄嘌呤素促进神经胶质瘤细胞凋亡。
　　 为了确定黄嘌呤素诱导的神经胶质瘤细胞凋亡是否与UPR激活有关，出国看病网研究人员检查了神经胶质瘤细胞中UPR通路相关蛋白的表达。C6和U251细胞中的普通ER应激标志物GRP78暴露于黄嘌呤后显着增加，表明发生了ER应激。为了确定是否响应黄嘌呤治疗激活了UPR的三个规范信号分支，磷酸化的IRE1α和磷酸化的eIF2α的水平可以被磷酸化的蛋白激酶R磷酸化型内质网激酶激酶，首先被检测到。与对照细胞相比，黄嘌呤暴露后C6和U251细胞的相对水平增加。此外，XBP1s在暴露于黄嘌呤的神经胶质瘤细胞中也有所增加。磷酸化的eIF2α的水平在C6细胞和U251细胞中也有所增加，伴随着ATF4的增加，ATF4是由PERK–eIF2α信号传导途径诱导的转录因子，并可以激活CHOP。这些发现的共识是，黄嘌呤治疗引起CHOP的核易位，CHOP是一种通常被隔离在细胞质中的核转录因子。此外，黄嘌呤素上调了ATF6表达，这可能导致CHOP进一步增加。实时定量聚合酶链反应还表明黄嘌呤素上调了UPR相关基因GRP78，XBP1s，ATF4，CHOP和PERK的水平，但对eIF2α的水平没有明显影响。总的来说，这些发现表明黄嘌呤在胶质瘤细胞中诱导ER应激并伴随CHOP活化。
　　 为了评估黄体素的体内抗癌作用，携带神经胶质瘤异种移植物的无胸腺小鼠连续14天接受腹膜内注射黄体素。与媒介物对照组相比，黄嘌呤素以剂量依赖的方式减少了神经胶质瘤的体积。TMZ是一种广泛用于治疗原发性和复发性高级别神经胶质瘤的烷基化剂，它也将肿瘤大小降低到与暴露于20mg/kg的黄嘌呤组相似的水平。去除肿瘤后，用黄嘌呤酮以40mg/kg剂量治疗的小鼠的平均肿瘤重量比用赋形剂治疗的小鼠的平均肿瘤重量低两倍。此外，注射黄嘌呤素的胶质瘤异种移植小鼠以及TMZ组小鼠的肿瘤组织中的坏死面积迅速增加。此外，黄嘌呤素，特别是40mg/kg，显着上调了ER应激蛋白的磷酸化-IRE1，ATF6，磷酸化-eIF2α，XBP1s和ATF4，这与体外结果一致。在黄嘌呤治疗的异种移植小鼠中还观察到了肿瘤组织中GRP78和CHOP的免疫反应性增加。此外，与对照组相比，黄嘌呤治疗组的肿瘤组织中CHOP和裂解的caspase-3的表达也升高了。然而，黄嘌呤对体重的体重或血清含量无明显影响。这些发现表明，xanthatin触发神经胶质瘤异种移植物中与ER应激相关的细胞死亡。
　　 为了验证ER应激在xanthatin诱导的细胞凋亡中的作用，4-PBA的能力，化学伴侣，通过减少在ER错折叠蛋白的积累抑制ER应激，以改善的细胞毒性作用黄体素对神经胶质瘤细胞的影响。与仅用黄嘌呤素处理的C6细胞相比，用4-PBA预处理增加了用黄嘌呤素处理的C6细胞的活力。此外，4-PBA部分逆转了由黄嘌呤诱导的裂解的caspase-3和CHOP的增加以及Bcl-2/Bax比率的降低。作为阳性对照，使用市售的ER应激诱导剂衣霉素增强ER应激。TM处理导致C6细胞中CHOP急剧增加并裂解了caspase-3表达，Bcl-2/Bax比值显着降低，而4-PBA预处理也部分减弱了这种表达。同时，与仅用黄嘌呤处理的C6细胞相比，TUNEL分析显示了用4-PBA预处理4h和黄嘌呤处理12h的TUNEL阳性C6细胞的比例相对降低。这些结果表明内质网应激与黄素素诱导的神经胶质瘤细胞死亡有关。为了进一步探讨促凋亡因子CHOP是否是黄体素诱导的细胞凋亡的重要因素，将CHOPsiRNA转染到C6细胞中。与黄嘌呤素和NC-siRNA处理的细胞的生长相比，黄嘌呤素暴露与CHOP敲低相伴的C6细胞生长增加了36.5％。进一步的研究表明，与用NC-siRNA转染的细胞相比，CHOP的敲低降低了切割的caspase-3表达并增加了Xanthatin处理的细胞的Bcl-2/Bax比值。综上所述，这些结果表明黄嘌呤诱导的神经胶质瘤细胞凋亡至少部分地由涉及CHOP诱导的ER应激途径介导。
　　 虽然已经xanthatin在体外各种人癌症中被牵连作为抗肿瘤疗法，其对神经胶质瘤细胞的增殖或细胞凋亡作用没有详细的研究已进行。以前的放射学研究数据表明，黄嘌呤素的抗神经胶质瘤作用与抑制血管生成有关。黄嘌呤酮抗肿瘤活性的确切分子机制尚未阐明。强调黄嘌呤对神经胶质瘤细胞生长的强剂量和时间依赖性抑制作用。更重要的是，黄嘌呤对非恶性神经胶质细胞的生存能力影响很小。使用C6异种移植小鼠进一步证实了这些数据，这些小鼠在施用黄嘌呤后显示出缓慢的肿瘤生长和减轻的肿瘤重量。同时，黄嘌呤素对异种移植小鼠的体重或肝或肾功能无明显影响。这些结果表明黄嘌呤素具有相对较低的细胞毒性，并且在临床应用中可能具有巨大的神经胶质瘤治疗潜力。Xanthatin诱导的神经胶质瘤细胞凋亡明显，这表明xanthatin诱导的对神经胶质瘤生长的抑制主要依赖于凋亡的诱导。黄嘌呤酮对神经胶质瘤细胞的周期停滞没有影响，这与其他小组的观察结果相反，其他小组的观察结果表明，黄嘌呤酮通过诱导人肺癌细胞，胃癌细胞和人的G2/M细胞周期停滞发挥其抗肿瘤活性。乳腺癌细胞系。结果的差异可能与所检查的肿瘤类型有关。
　　 为了进一步研究黄嘌呤诱导细胞凋亡的机制，出国看病网研究人员表征了黄嘌呤对细胞凋亡相关信号通路的影响。xanthatin类似物1B-羟基-5α-氯8-epi-xanthatin通过ROS介导的ERK/p38MAPK活化和JAK2/STAT3抑制作用诱导人肝细胞癌凋亡。此外，xanthatin诱导通过p53依赖性内在线粒体途径，氧化应激，和NF-KB[灭活肿瘤细胞凋亡。ER应激是否在黄体素诱导的神经胶质瘤细胞凋亡中起重要作用尚不清楚。越来越多的证据表明，ER应力是双刃剑充当细胞死亡机制，也延长癌细胞的肿瘤发生的存活。因此，许多当前抗癌治疗诱导ER应激刺激其促凋亡功能或阻断其促存活功能已经设计。PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径是主要的UPR途径之一。PERK信号的激活在很大程度上不受ER缓解，并且持续的PERK信号削弱细胞增殖并促进细胞凋亡。通过磷酸化eIF2α和激活ATF4，PERK诱导CHOP表达。CHOP下调Bcl-2表达并增加Bax从胞质溶胶到线粒体的转运，从而触发caspase-3活化，导致细胞凋亡。在出国看病网研究人员的研究中，黄嘌呤暴露后，神经胶质瘤细胞和异种移植物中磷酸化-eIF2α，ATF4和CHOP的水平显着增加，伴随着CHOP的核易位，这表明PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径参与其中黄体素诱导的细胞凋亡。CHOP敲低为C6细胞增加了对黄嘌呤诱导的神经胶质瘤细胞凋亡的抵抗力，进一步证实CHOP是黄嘌呤诱导的神经胶质瘤细胞凋亡的重要因素。
　　 Xanthatin还增加了磷酸-IRE1α，剪接的XBP1和ATF6的水平，这暗示这两个UPR信号通路也参与了xanthatin诱导的神经胶质瘤细胞凋亡。ER应激抑制剂4-PBA可以部分缓解黄嘌呤诱导的肿瘤细胞生长抑制作用，并降低神经胶质瘤细胞的凋亡率，这也证实了ER应激在黄嘌呤活性中的关键作用。鉴于这项研究中使用的指标数量有限，出国看病网研究人员不能排除其他与UPR相关的蛋白或与细胞凋亡相关的信号通路与黄嘌呤诱导的细胞死亡有关的可能性。尽管出国看病网研究人员的初步数据表明黄嘌呤对C6细胞中的五个氧化应激相关基因的表达没有影响，在经过xanthatin处理的细胞中，通过4-hydroxynonenal染色评估的氧化应激略有增加。因此，氧化应激，特别是4-HNE所揭示的氧化应激是否参与了黄嘌呤素诱导的神经胶质瘤细胞凋亡以及黄嘌呤素作用的潜在机制。总而言之，出国看病网研究人员的当前研究强调了黄嘌呤素治疗可增强神经胶质瘤细胞系和异种移植肿瘤中的ER应激，从而导致细胞凋亡和肿瘤生长抑制。用经典的ER应激抑制剂4-PBA或CHOP敲低处理可部分改善黄嘌呤对胶质瘤细胞的细胞毒性作用，同时下调裂解的caspase-3。这些结果可能有助于确定黄嘌呤素作为胶质瘤靶向治疗的潜在候选药物。