抑制胶质母细胞瘤细胞中的细胞增殖 |
恶性神经胶质瘤是中枢神经系统的致命和顽固性癌症之一,其占恶性脑肿瘤的约80%。高的网络ltrative增长是胶质瘤的最明显的特征,导致其高侵略性的功能和频繁复发。胶质瘤患者具有较差的总体生存,以约9.7个月的平均生存时间和5年生存率低于5%。在世界卫生组织的基础上,胶质瘤的等级根据恶性程度分为I至IV级。胶质母细胞瘤被定义为WHOIV级,统计数据表明,它被认为预后最差,并且普遍和广泛存在,每年约有10000例新诊断病例。尽管很多进步,如新颖的手术策略已获得GBM的治疗,患者仍然预后差,复发率较高。侵入性手术和放疗的关键障碍是神经胶质瘤细胞的转移特性。障碍还含有耐药性,神经胶质瘤细胞及细胞增殖失控的细胞凋亡,并在渗透快速分散。开发更有效的治疗方法,深入研究GBM进展的分子机制,探索新的诊断和预后生物标志物迫在眉睫。
两种粘病毒抗性基因-MX1和MX2人染色体21q22.3,其产生由基因复制事件。这两个基因编码的属于家族的发动状鸟苷的MXA和MXB蛋白质。人MxA蛋白用于通过二FFerent机制的多种病毒,包括DNA病毒和RNA病毒显示极大的抗病毒活性。有63%相同的氨基酸序列的两个人MXB和MxA蛋白,蛋白质中的一个的三维结构是与所述其他几乎重叠。它充当了干扰素诱导的制约因素靶向HIV-1,这可以结合HIV-1衣壳和抑制其核进口,最终导致其复制在入境后步骤抑制。表明MXB参与了先天免疫反应,这对病毒感染和肿瘤发展都非常重要。MXB包括核定位信号并出现在核孔复合物中,这表明它在细胞周期的进展中起重要作用并影响核输入。研究人员假设MX2基因的表达水平可能参与人类肿瘤的发展。关于其在癌症中的功能的研究很少。研究人员首先检查了GBM和四种人脑胶质瘤细胞系患者的MX2表达。同时,通过Kaplan-Meier方法分析GBM患者的总体存活率。然后进行细胞转染实验以建立具有稳定过表达MX2的神经胶质瘤细胞。研究了MX2对细胞活动的影响,包括增殖,迁移和侵袭,并试图解决其在胶质瘤中的潜在机制。胶质母细胞瘤患者手术中共获得33对GBM组织和相应的正常组织。将所有组织样本保存在液氮中直至测试。根据世界卫生组织的标准,病理证实了GBM患者的诊断。所有患者的临床病理特征,包括年龄,性别,WHO等级和MX2。
所有细胞在RoswellParkMemorialInstitute-1640培养基中培养,补充有10%胎牛血清,100U每毫升青霉素和100ug每毫升链霉素,温度为37°C。在5%CO2气氛中。当细胞处于对数期时,将它们用胰蛋白酶消化并重悬于培养基中用于进一步的实验。使用Chat-green荧光蛋白Mx43质粒进行细胞转染以稳定过表达MX2。首先在包含10%FBS的Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium中培养U251人神经胶质瘤细胞。然后根据说明使用Lipofectamine2000试剂将GFP-MX2质粒转染到U251细胞中。G418用于选择稳定过表达MX2的U251细胞。根据用户指南,使用TRIzolregent提取组织或细胞的总RNA。然后用于合成互补DNA的逆转录酶M-MLV。最后,使用SYBRPremixExTaqTM试剂盒通过定量逆转录聚合酶链反应测定法检测样品中的MX2表达水平。
通过3-2,5-二苯基四唑溴化物测定来检测MX2对癌细胞活力的影响。首先将5000个U251细胞接种于每孔96孔板中24小时,然后用GFP-MX2质粒转染。在测量之前,向每个孔中加入20uLMTT溶液并继续孵育4小时。然后在除去培养基后向每个孔中加入100uL二甲基亚砜。通过ELISA读数器测量560nm处的光密度。所有测定重复三次。研究MX2的分子机制,细胞外信号调节激酶抑制剂,p38抑制剂和核因子-κB抑制剂,二硫代氨基甲酸酯分别加入转染GFP-MX2质粒或未转染的U251细胞中。使用相同的方法检测细胞活力。使用transwellchamber和基质胶侵袭进行细胞迁移和侵袭测定。在细胞转染后48小时,将无血清培养基中的U251细胞接种到涂有或不涂有10ug每毫升基质胶的上室中。将含有10%FBS的介质加入下室中。孵育48小时后,将迁移或侵入的细胞在甲醇中固定并用0.1%结晶紫染色。最后,在显微镜下计数染色的细胞。
使用放射免疫沉淀测定缓冲液裂解U251细胞。通过BCA蛋白质测定试剂盒测量蛋白质的量。通过10%十二烷基硫酸钠凝胶电泳分离蛋白质,并电泳转移到聚偏二氟乙烯膜。接下来,将膜用5%牛奶封闭1小时,与第一抗体在4℃温育过夜,与第二抗体一起温育。洗涤膜后,使用增强的化学发光检测试剂盒检测信号。所有抗体均购自CellSignalingTechnology,包括抗B-肌动蛋白,抗p38,抗磷酸化p38,抗ERK,抗磷酸,抗NF-κBp65,抗核纤层蛋白B和抗B-作用。B-作用是加载对照。
为了挖掘MX2如何参与GBM,检查了其在33对GBM组织和相应的相邻正常组织中的表达水平。,MX2的在GBM组织中的表达比非癌性组织中较低水平。为了验证MX2是否在胶质母细胞瘤中下调,还测试了其在四种GBM细胞系和正常人星形胶质细胞HEB中的水平。4个GBM细胞中的MX2水平也低于正常星形胶质细胞。所有这些都暗示MX2可能参与GBM的发病机制。在4个GBM细胞中,U251细胞具有最低的MX2水平,因此选择它用于细胞转染以深入研究MX2的功能。Kaplan-Meier模型用于分析MX2水平与GBM患者术后生存率之间的相关性。结果表明具有较低MX2表达水平的患者总体存活率较差,这意味着GB2患者的MX2表达水平与术后存活率之间存在负相关。MX2可能是GBM患者预后的候选生物标志物,也可能对GBM进展具有抑制作用。
为了研究MX2在GBM中的作用,研究人员将GFP-MX2质粒导入U251细胞并使用G418进行选择。转染后,qRT-PCR检测MX2表达。MX2在MX2-U251细胞,这表明U251细胞稳定过表达MX2,已经成功建立。根据以往的研究,MX2可能与GBM的进展有关。研究了它对GBM细胞的生物学作用,包括增殖,迁移和入侵。MTT试验表明MX2转染的U251细胞的OD明显低于未转染的细胞,这意味着高MX2水平可抑制U251细胞的增殖。跨孔测定证实MX2过表达能抑制显著U251细胞迁移和侵袭。所有这些结果表明MX2可能作为GBM的癌症抑制因子。为进一步揭示MX2过表达U251细胞的机制,Westernblot检测MX2对细胞活性的影响是否与信号通路有关。对于MX2-U251细胞,磷酸化ERK,p-p38和NF-κB的相对水平显着低于未转染的水平,而ERK,p38和核纤层蛋白B1的水平由于MX2上调而没有明显改变,这表明MX2的功能可能与ERK信号通路有关。为验证这种推测,NF-κB抑制剂,P38抑制剂和ERK抑制剂分别用于转染GFP-MX2质粒的U251细胞。表明添加三种抑制剂可明显促进MX2水平高的U251细胞增殖,表明它们具有逆转MX2过表达诱导的作用的能力。这三个抑制剂也可以显著削弱MX2过表达对细胞迁移和侵袭的影响。这些实验结果表明PD98059,SB203580和PDTC对MX2上调诱导的细胞增殖,迁移和侵袭作用具有逆转作用,表明MX2可能通过激活ERK信号通路发挥抑制性癌症作用。
胶质瘤是人脑中最常发生的原发性恶性肿瘤,存活率低,死亡率高。胶质瘤生物标志物作为工具,有助于改善临床结果,对其诊断具有重要意义。有3000到5000个分子靶标可能作为人类基因的药物,但其中,不到半个药物靶标被接受。在胶质瘤患者预后根据组织学分级,通常进行评价。新型生物标志物的鉴定对于胶质瘤的诊断和预后仍然是非常迫切的,其对于胶质瘤患者的新疗法的开发也具有必要的功能。
MX蛋白是干扰素诱导的粘病毒动蛋白样GTP酶,并且在许多哺乳动物中广泛退出,例如绵羊,猪和马。有两个MX蛋白质,MXA和MXB。MXA具有广泛的抗病毒活性,而MXB被认为缺乏抗病毒活性。最近的实验证明MX2基因编码的MXB蛋白是干扰素诱导的HIV-1限制因子。很少有研究探讨MX2基因的表达水平是否与肿瘤的发生和发展有关。与正常组织和细胞相比,GBM组织和四种神经胶质瘤细胞中MX2的相对信使RNA水平显着降低,尤其是在U251细胞中。对患者存活率的分析表明,较低水平的MX2代表较差的预后。这些结果表明MX2可能与GBM进展相关,并且有望成为用于确定GBM预后的候选生物标志物。
海外医疗网的研究人员初步检测了MX2过表达对U251细胞增殖的影响。数据显示,MX2表达水平的增加可明显抑制细胞增殖,这意味着它可能能够延长胶质瘤细胞的细胞周期。由于GBM也具有快速转移特征,进一步进行了transwell实验,以确定MX2是否也影响细胞迁移和侵袭。MX2过表达对胶质瘤细胞的迁移和侵袭具有显着的抑制作用。为了进一步研究MX2基因在胶质瘤中的分子机制,将三种抑制剂用于过表达MX2的U251细胞。结果表明其功能参与ERK信号通路,这可能与细胞中MXB蛋白的结构和功能有关。由MX2基因编码的人MXB蛋白由715个氨基酸构成,并且具有两种从同一mRNA翻译的同种型,同时以两种替代ATG开始。这导致产生一个长同种型和短同种型的;它们在前25个N-末端氨基酸中不同。长同种型包括43个残基的N-末端延伸,其具有核定位信号并且具有优先将必需的蛋白质定位于核孔的能力。但短的MXB形式缺乏核定位序列并且在细胞质中。由于其特殊的结构,MXB被认为在细胞周期和核进口管理方面发挥着作用。MXB可以通过抑制其核进口阻断HIV-1感染。推测MX2可能通过调节核输入或其他方法来操纵信号通路。仍然需要进行深入研究来验证这一假设。表明MX2有可能成为确定GBM诊断和预后的生物标志物,并且可能通过操纵ERK信号通路抑制胶质瘤的进展,这有助于开发更有效的治疗方法。胶质瘤患者的方法。
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