根据目前的国际共识，四个主要的分子髓母细胞瘤亚组与发散组织学，生物学和临床结果存在。在SHH激活的MB亚组内，可能会发生广泛的组织学变异，包括增生性MB，具有广泛结节性的MB，经典和大细胞-每个均与特定的分子特征和临床相关当然。MBEN占所有MB的3–5％，主要发生在婴儿中。在这个年龄组占所有病例的大约20％和SHHMB的实质部分。尽管MBEN在当前的WHO中枢神经系统肿瘤分类中已被概述为不同的MB组织学变异，但DNMB和MBEN有时被视为同源的SHHMB实体。因此，有些MB临床试验中没有单独的患者，这些组织学类型，考虑到事件生存率没有差别在两者之间显著。传统上，MBEN与良好至优异的结局相关，在某些系列中总体生存率几乎达到100％。在另一方面，组织学也有报道用MBEN肿瘤显示不利的临床过程。种系PTCH1/SUFU突变被鉴定为MBEN进展的分子标志，这表明组织学均匀性CNS肿瘤的临床-生物异质。最近，显示DNMB和MBEN由不同的转录程序驱动，并伴随其临床过程的变异。还提出MBEN队列中的某些转录异质性，但是有限的样本数不能得出可靠的结论因此需要进行更详细的研究。在研究中，对大型多机构MBEN队列进行基于DNA/RNA的综合分子分析，并采用患者随访数据发现可能导致MBEN结果变异的分子事件，并可能解释潜在的生物学机制在某些情况下具有侵略性的临床行为。经验表明，这种综合分子的方法是非常有用的的各种CNS肿瘤实体的诊断和预测算法的阐述，并且因此可能是在诊所直接实际应用很有帮助。
　　 根据2016年WHO对中枢神经系统肿瘤的分类，从41例组织学诊断为“具有广泛结节的髓母细胞瘤”的儿科患者中获取组织和血液样本。所有患者最初在NNBurdenko神经外科研究所，海德堡大学，OspedaleSantobono-Pausilipon，BambinoGesù儿童医院，A.Meyer大学儿童医院，波里利尼科.翁贝托一世大学，神经病学研究所和华盛顿大学。从其他来源获得的16个额外MBEN样品中的FFPE未染色肿瘤切片仅从免疫组织化学分析中获得。所有患者的父母或其他监护人均已获得知情同意。这项回顾性研究是在地方道德委员会的主持下进行的。组织学上鉴定具有最高可用肿瘤含量的代表性组织样品，进行显微解剖，然后选择进行核酸提取。使用具有纯化试剂盒或试剂盒的自动系统，从福尔马林固定和石蜡包埋的组织样品中提取DNA和RNA，根据制造商的说明。为了评估FFPERNA的质量，出国看病网使用大于200nt片段测定值的RNA片段百分比。DV200大于70％的RNA样品仅包括在进一步分析中。
　　 使用Illumina人甲基化450或850K的分析DNA/EPIC珠芯片如前所述阵列。为所描述的所有DNA甲基化分析是作为R版本3.3.0执行。使用软件包1.18.2版从IDAT文件获得原始信号强度。通过对两个颜色通道执行背景校正和染料偏倚校正，将每个样品分别归一化。没有进行进一步的标准化或转化步骤，并且将标准B值用于下游甲基化分析。采用以下标准来过滤出容易产生不准确甲基化水平的探针：去除针对X和Y染色体的探针，去除与CpG或以下碱基内的常见SNP重叠的探针，并去除不唯一映射到人类参考基因组的探针。为了使Methylation450和850k/EPIC阵列之间具有可比性，删除450k阵列上未显示的所有探针。总共保留428,799个探针用于分析。对于无监督的分层聚类，出国看病网选择整个数据集中的10,000个变化最大的甲基化探针，以标准差进行测量。使用Pearson相关系数作为距离度量和平均连锁度对样本进行聚类。使用欧几里得距离和平均链通过层次聚类对甲基化探针进行重新排序。使用t进行肿瘤亚组的其他分析分布式随机邻居嵌入系的方法。DNA甲基化原始数据可应要求提供。
　　 使用200ng剪切的DNA构建分子条形码索引的基于连接的测序文库。文库通过杂交捕获与生物素化的定制寡RNA池覆盖的130癌相关基因外显子富集。使用NextSeq500进行配对末端测序。使用Burrows-WheelerAligner将序列数据定位到参考人类基因组，并使用公开可用的SAM工具进行处理。仅包括标注为“外显子”或“剪接”的变体，“基因间”和其他未翻译的区域除外。PTCH1，SUFU和SMO的复发性基因突变还用来自同一池的残留DNA进行评估，该DNA用于通过聚合酶链反应进行测序，然后直接对相应外显子进行Sanger测序。可应要求提供下一代测序原始数据。物上的NextSeq500如先前所述执行的处理的41个MBEN样品被足够质量和数量的RNA是可利用的RNA测序。读取用STAR版本2.5.2b对准hg19参考和对每个样品，基因表达受特征计数定量模块的使用Gencode版本19个注解Subread包1.4.6版，并考虑唯一映射只读取。为了识别潜在的低质量或离群样品，使用Qualimap2.2.1版进行质量控制和多样品比较。使用主成分分析t分布随机邻居嵌入和基于log2RPKM基因表达标准化的前1000个和500个最易变基因的选择进行分层聚类，进行无监督的肿瘤样本比较。通过使用DESeq2R软件包将一种分子类别与另一种分子类别进行比较，进行亚组特异性差异基因表达分析。RNA测序原始数据可应要求提供。基因本体分析是使用ClueGO将各个分子类别中表达最强的250个基因组合在一起，然后使用高级版进行可视化。如前描述基于RNA测序数据融合发现已完成。还使用定量逆转录实时聚合酶链反应相对测量了选定候选基因的mRNA水平。
　　 免疫组织化学在厚度为4um的福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片上进行，该切片固定在载玻片上，然后在80°C下干燥15分钟。为了对visinin样1蛋白进行IHC分析，使用单克隆抗体。使用自动免疫染色剂，使用抗原回收方案CC1和工作抗体稀释比例为1：100并在37°C下孵育32分钟进行IHC。根据Kaplan–Meier方法，使用对数秩检验检验显着性，计算总生存期和无进展生存期的分布。从诊断之日起，直到无病患者的肿瘤复发或最后接触为止，计算PFS和患者的OS，直至患者因疾病离开或直到最后一个仍然活着为止。对于多变量分析，使用Cox比例风险回归模型。估计的危险比具有95％的置信区间和Wald检验的p值，低于0.05的测试被认为是有意义的。对41个MBEN样品进行RNA测序分析，其中22个包括在先前的研究中，新招募19个。分层此MBEN队列的分子表征，进行无监督层次聚类中，主成分分析和吨-分布式随机邻居嵌入基于前500个高变异基因的分析。所有方法均表明，可以将41MBEN的表达特征清楚地分为两个转录组，分别包含22个和19个样品。当使用不同数量的可变表达基因时，这两个簇保持稳定，因此证实表达谱数据能够可靠地区分这些转录组MBEN变体。在两个亚组中，从“老布尔登科”和新招募的队列中获得的病例比率相似；11比8；“TCL2”，因此不包括任何源生成的批处理效果。
　　 比较表达水平，检测到5370个基因，并处理这些MBEN转录组亚组之间差异调节的假基因。所选择的组的最顶部的信心40个基因“TCL1”并允许明确鉴别“TCL2”MBEN子组。对五个选定的基因进行了定量逆转录实时PCR验证：两个来自“TCL1MBEN”，三个来自“TCL2MBEN”。还在qRT-PCR分析的基因组中添加SNORD家族基因的两个探针，因为该snoRNA库中的大多数基因在“TCL2MBEN”中显着上调。与RNA测序实验一致，“TCL2MBEN”的12个RNA样品显示所有五个推定标记基因的统计学显着较高的表达水平，而“TCL1MBEN”的8个肿瘤。相反，“TCL1MBEN”队列通过qRT-PCR测得的ZNF217和FZD8表达高于“TCL2MBEN”。
　　 描绘特性信令模式为每个这些转录衍生MBEN亚组，使用基因本体分析途径识别。“TCL1MBEN”亚组的转录组签名的特征在于涉及DNA复制，RNA转运，细胞周期激活，p53信号传导，病毒致癌作用和各种癌症相关途径的基因。相反“TCL2MBEN”亚组富含与神经元功能，突触传递，神经内分泌，肌肉收缩和血小板活化有关的基因集。基因融合转录本通过各种算法分析，并通过直接RNA测序进行确认。然而，仅检测到少数且非周期性的基因融合体，并且这些融合体与任何特定的MBEN转录组均无关。为了确认已鉴定的MBEN转录组变异体的存在和稳定性，并排除可能的分批效应，使用MBENRNA测序数据以及其他两个SHHMB组织分子变异体生成的数据进行无监督的聚类，PCA和tSNE分析-DNMB和具有TP53突变的大细胞SHHMB-因此涵盖了SHH相关MB的大部分光谱。即使在这个扩大的SHHMB数据集中，“TCL1MBEN”和“TCL2MBEN”子组仍然保持稳定并分别聚类，但在DNMB队列中分布了三个“TCL1MBEN”样本。DNMBRNA图谱与为SHH生成的图谱聚在一起TP53MB，从而暗示这些SHHMB变体内的转录重叠，并支持先前发现的具有DNMB组织学的肿瘤转录组异质性。
　　 所有41名MBEN患者的基本临床分子特征。两个MBEN转录组亚组之间的患者年龄或男女比例无差异。在诊断时，这些分子亚组中有类似比例的患者显示出M2–3期，并且报告相同数量的总肿瘤切除术。所有41名患者接受类似“婴儿”的治疗方案：HIT-SKK化疗脑室甲氨蝶呤。MBEN系列的11例患者观察到了肿瘤复发：其中7例为局部再生长，其他4例为局部复发合并脊柱转移。五例患者死于疾病进展。大多数复发和所有死亡都发生在“TCL1”亚组的MBEN患者中。因此，对于带有“TCL1MBEN”分子标记的肿瘤患者，无进展和总生存期明显较差。组织学上，两者所概述MBEN转录变体公开的原型的双隔室微观外观包括含有细胞与神经元成熟的各种模式的结节自由网硬蛋白区和与有丝分裂活性的间质，富网硬蛋白的组分。两个MBEN转录组变体之间没有组织病理学差异，并且结节和结节间区域的程度在它们之间没有变化。在两个亚组的结节成分中也鉴定出NeuN的核表达。MIB1核表达主要在结节间区域观察到，两种转录组变异体的中位标记指数相似。
　　 为了避免肿瘤内MBEN异质性对获得的测序结果的影响，另外从14个样品的两个不同肿瘤区域中提取了RNA。这些分析的数据证实了定义的“TCL1/TCL2”MBEN转录组二分法，显示了从大块MBEN样品或单个肿瘤内两个不同区域生成的RNA测序图谱几乎完全相似。两个转录组亚组之间具有平衡CNV谱或显示复发性染色体畸变的MBEN样本数量相似。使用靶向的NGS，按照所述方法分析了肿瘤并匹配正常的DNA。在所有研究样品中检测到单个体细胞核苷酸变异和小的缺失。复发性改变影响三个“原型”SHH相关基因：PTCH1，SUFU和SMO，它们都是互斥的。还发现KMT2D的频繁突变。全部12SUFU匹配的种系DNA中也存在突变和4/16PTCH1改变，大部分出现在“TCL1MBEN”队列中。然而在诊断时，除MBEN以外，均未发现任何病例认识到空洞的基底细胞癌综合征的明显临床表现。MBEN亚组之间基因改变的平均数无差异：每个肿瘤分别为2.8±1.3和3.1±1.3，但发现突变态势有些差异。苏富，PTCH1和KMT2D突变在“TCL1MBEN”亚组中发生的频率明显更高。相反在“TCL2MBEN”队列中检测到了所有SMO，NF1和PTEN突变。“TCL1MBEN”亚组中的大多数PTCH1和SUFU突变是多重的，其中一些显示同一肿瘤样品中SNV或indel的各种组合，而“TCL2MBEN”中的突变主要是单个SNV或indel。所有PTCH1与“TCL1MBEN”队列中同时检测到SNV或indel的人群相反“TCL2MBEN”的更改为indel。“TCL1MBEN”PTCH1改变主要影响第18外显子。对于18个MBEN样品，还从同一肿瘤的两个不同区域分别提取和分析DNA。这表明在所有18例病例中，两个区域之间的突变谱完全重叠。
　　 在Illumina450k或850k/EPICBeadChip甲基化阵列上分析41个MBEN样品的DNA。无监督层次聚类分析揭示了两个主要亚组后生，其中并没有完全与子组由RNA测序中。因此，“TCL1”和“TCL2”MBEN在表观遗传水平上并不一样，并且它们的分布图在先前报道的MBEN甲基化组中都混杂在一起。这些数据也通过t-SNE分析得到证实。尽管“TCL1MBEN”样本更常见于SHH-I表观遗传簇，而“TCL2MBEN”主要在SHH-II甲基化亚组中发现，但这两种技术显然不要在此SHHMB变体中标识完全相同的子集。反过来MBENRNA测序型材tSNE分析揭示肿瘤样品显示任一种SHH-I或SHH-II甲基化签名。另外使用q值限制为0.05的SHH-I和SHH-IIMBEN之间的差异表达分析仅揭示了31个差异表达基因，与确定的大于5000个差异表达基因形成鲜明对比一样的两个已识别的MBEN转录组亚组之间的q值限制。与MBEN转录组相比，表观遗传的SHH-I和SHH-II亚组显示出患者年龄，男性与女性比例以及复发性CNV分布的差异。同样，PTCH1/SUFU种系的变化均匀地分布在两个甲基化组之间。在表观遗传MBEN簇之间未观察到生存差异，这表明SHH-I和SHH-IIMBEN签名的临床相关性有限，至少对于使用HIT-SKK方案治疗的患者而言。这也符合出国看病网先前针对MBEN/DNMB混合婴儿队列获得的数据。最后，直接比较表观遗传和RNA测序数据，但未发现“TCL1”和“TCL2”MBEN亚组之间差异表达的顶级基因的甲基化状态发生任何变化，因此表明这些歧视性基因的转录活性是不受DNA甲基化状态的调节。
　　 与以前报道的数据线，种系PTCH1/SUFU突变与MBEN患者更糟糕的结果相关联。就PFS和OS而言，发现“TCL2MBEN”分子亚组与患者的良好存活相关。经过多变量分析，因素“MBEN转录组亚组”被确定与不良的PFS和OS相关。OS分别；p小于0.01）。另外比较两个概述的MBEN转录组变体的生存数据，以及为具有TP53突变的SHHDNMB和SHHLCAMB生成的变体。在“TCL1MBEN”和DNMB队列之间的生存率方面没有发现显着差异。然而，肿瘤被分配为“TCL2MBEN”和SHHTP53MB分子亚组的患者分别表现出优异的生存率和惨淡的生存率，因此代表SHHMB谱图的两个相对的临床和生物学终点。
　　 在临床上有利的队列中过表达的基因中，选择VSNL1进行进一步的免疫组化分析，因为它在该肿瘤组中具有高表达水平，其他SHHMB组织分子变体以及非SHH组3和4MB分子亚组和市售抗体的可用性。应用visinin样蛋白1单克隆抗体OTI4A6可以染色RNA测序实验中涉及的所有41个MBEN样品，以及另外16个因缺乏高质量RNA而无法进行转录组分析的MBEN样品。检测到细胞质免疫染色VSNL1通过以下三种模式：“漫”-肿瘤样品完全并强烈染色，包括结节性MBEN成分和间结节区域的细胞的集合。“焦点”-patched，单个异构染色强度的细胞的集合在结节性组件只。“阴性”-在整个MBEN样品中均未发现VSNL1表达。来自“TCL2MBEN”组的所有19个MBEN样品均显示出VSNL1的弥散免疫染色模式，而来自“TCL1MBEN”组的肿瘤则显示了局灶性VSNL1表达或完全阴性。在来自非RNAMBEN队列的其他16个样品中，有6个肿瘤的VSNL1弥漫阳性，有6个阳性，其余4个样品没有蛋白表达。出国看病网还在64个DNMB样品上测试了该VSNL1抗体，其中只有四个肿瘤显示局灶性免疫染色仅限于“苍白的岛”。此外，带有TP53的SHHMB的所有14个样本VSNL1突变对VSNL1是免疫阴性的，而在84个3/4MB组中，只有8个样品显示有VSNL1阳性细胞质的散在细胞，并且四个肿瘤含有捕获的正常小脑的小免疫染色片段。在分析VSNL1表达的整个MBEN集中，比较弥散性染色和局灶性表达或不染色的肿瘤的生存数据。发现带有弥散性染色MBEN的患者的PFS和OS明显更好。还分别用病灶阳性和阴性分析MBEN的存活率，但在临床结局上未发现任何差异。因此这些结果证实通过转录组分析获得的存活数据。因此认为VSNL1是MBEN患者预后分层的合适IHC指标。
　　 髓母细胞瘤具有广泛的结节是婴儿SHHMB的一种罕见的组织学变体，其传统上被认为是组织-分子均匀且临床上有利的CNS肿瘤实体。但是在大型MBEN肿瘤系列中应用基于DNA/RNA的整合分子方法，发现即使是这种罕见且组织学上均一的SHHMB变异体，其基因表达特征也可能会进一步分层。MBEN队列揭示两个数字明确大小相同的清晰分子亚组，它们由不同的转录程序生物学驱动。反过来，这种不同的MBEN生物学与不同的临床进程和肿瘤治疗反应相关。不利的“TCL1MBEN”集的基因表达特征由多种与癌症相关的途径组成，这可能解释它们的侵略性临床过程。通过DNA甲基化分析鉴定出的两个表观遗传MBEN子集包括来自两个转录组亚组的样品，并且未发现与患者预后相关。此外与转录组MBEN亚组相反，表观遗传簇明显与年龄相关。SHHMB的表观遗传状态在肿瘤起始和保持稳定的时间定义的一致性，而转录程序可能肿瘤发生和发展期间演变。另外，MBEN转录组特征与最差异表达基因的甲基化状态差异无关。因此，认为MBEN的转录多样性与表观遗传失调不可靠相关，可能受其他分子机制驱动。
　　 此外，在两个MBEN转录组亚组的突变景观中发现了明显的数值和结构异质性。不利的“TCL1MBEN”群组主要使用多个PTCH1/SUFU进行充实已发现60％的患者种系DNA中已经存在突变。这证明驱动SHH-途径基因改变在“TCL1MBEN”内“癌相关”途径的激活中的某些作用。MBEN中携带SHH“突变复杂性”的特定于癌症的转录程序的激活所基于的独特生物学机制仍有待确定。在另一方面，所确定的转录签名可以部分解释SHHMB的临床攻击行为确诊的PTCH1/SUFU生殖系的改变。值得注意的是，与SNORD家族相关的许多基因在“TCL2MBEN”亚组中过表达。这些基因编码一个小的核仁RNA库，通常在指导其他非编码RNA的修饰中起作用。SNORD115过表达诱导神经元分化，因此这些基因的上调可能在塑造与神经元相关的“TCL2MBEN”变体中起作用。
　　 VSNL1在“TCL2MBEN”前上调的基因中鉴定。基因产物类visinin样蛋白1在皮层神经元和小脑颗粒细胞中大量表达。它以钙依赖的方式与膜结合，从而调节神经元的形态，传递和可塑性。在结肠癌和神经母细胞瘤中，高水平的VSNL1表达与晚期肿瘤分期有关。相比之下，VSNL1的强大而无所不在的表达MBEN的升高与优异的预后相关，因此表明该神经元相关基因的上调可作为指示肿瘤生物学行为和临床进程的指标。鉴于MBEN转录组鉴定的可能的预后重要性，可以推荐VSNL1IHC作为合适的筛选工具，在没有突变或表达分析的情况下，它甚至可以充当替代标记。另外在小型活检样本中评估VSNL1免疫表达也可能具有区分“TCL2MBEN”和其他MB组织学的优势。反过来，MBEN患者可以进一步进行转录分层，以选择最佳治疗方法，HIT-SKK难治性患者“TCL1MBEN”可能会受益于更严格的前期治疗方案。此外，鉴定出的转录特征可以被认为是对耐药MBEN的治疗干预的潜在分子靶标。对于“TCL1MBEN”队列，用ZNF217或PARP4抑制剂进行分子靶向治疗可能是有效的，因为最近有报道称它用于中枢神经系统和非中枢神经系统癌症。有必要进一步研究转录定义的MBEN亚型的临床和治疗相关性。总之，组织学上一致的SHHMB变体命名为“MBEN”，具有临床相关的转录异质性，可将这些肿瘤分为两个明确的分子亚组：临床上具有侵略性的“与癌症相关的TCL1MBEN”和对预后良好的“神经相关的TCL2MBEN””。通过将突变和表观遗传学分析与转录组分析以及VSNL1IHC相结合，可以将MBEN患者彻底分为临床风险组。结果证明，即使对于罕见的中枢神经系统肿瘤实体，此类综合分析也能够检测临床相关标志物。