神经退行性疾病是由中枢神经系统慢性进行性退化引起的一类疾病的总称，例如脑营养不良，焦虑和抑郁，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症，亨廷顿氏病。这些不同类型的神经退行性疾病的病因和机制仍然未知；共同病理特征是神经元变性，髓磷脂损失，神经胶质细胞增生，肥大和炎症以及在CNS脑萎缩症。神经系统中的慢性炎症与神经退行性疾病的发展和进展有关，并且引起越来越多的关注。炎性损伤的干预可能是预防和治疗神经退行性疾病的重要方法之一。作为一种常见的三环抗抑郁药和抗失眠药，多塞平通常用于治疗抑郁症，失眠和多发性神经症。近年来，发现多塞平可以改善认知过程并保护中枢神经系统。研究表明，小剂量多塞平可以减少应激诱导的大鼠海马肿瘤坏死因子-a的释放以前的研究表明多塞平可以预防AB1-42诱导的大鼠记忆障碍。进一步阐明多塞平抗炎和神经保护作用的分子机制可能为神经退行性疾病的预防和治疗提供重要的理论和临床基础。先前的研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路与神经发炎有关，并显着促进各种神经退行性疾病的发病机理。考虑到脂多糖的神经炎症作用和星形胶质细胞在中枢神经系统炎症反应中的众所周知的作用，本研究目的是研究多塞平对C6胶质瘤细胞和LPS诱导的炎症的影响。PI3K/Akt途径在这些效应中的假定作用。
　　 大鼠TNF-aQuantikineELISA试剂盒和大鼠IL-1BQuantikineELISA试剂盒购自RayBiotech。针对GAPDH，LPS和盐酸多塞平的抗体购自SigmaChemicalCompany。针对Phospho-Akt，Pan-Akt，抗兔免疫球蛋白G的二抗和PI3K抑制剂LY294002购自CellSignalingTechnolgy。C6大鼠神经胶质瘤细胞获自中国科学院，并在Dulbecco改良的Eagle培养基基础培养基中培养，该培养基含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素，于37℃和5下培养％二氧化碳培养箱。达到70％至80％融合后，将细胞传代培养。在二甲亚砜中制备干燥的LPS和多塞平，以获得1uM和1千克每毫升储备液，然后以所需浓度添加到培养基中。对于所有实验，将细胞按照实验设计以合适的密度铺板并在处理前生长24小时。将C6细胞以1×105至5×105细胞/孔的密度接种到6至12孔组织培养板中。通过甲基噻唑基四唑鎓测定法确定细胞活力。进行MTT测定以评估细胞活力。将C6细胞在96孔板中培养24小时，然后再用LPS处理24小时。LPS处理后，将50uLMTT溶液添加到细胞中，使其反应2小时。后除去培养基，将100uLDMSO添加到细胞中以形成晶体。使用紫外/可见分光光度计在570nm下测量吸光度。结果表示为相对于对照条件的百分比。
　　 将C6细胞置于12孔板中，孵育24小时。按照制造商的方案和出国看病网研究人员先前的研究，使用EIAKit进行细胞培养上清液中TNF-a和白介素1B的释放。简而言之，分别用大鼠特异性TNF-a，IL-1B捕获抗体包被酶联免疫吸附测定板，并在4°C下孵育过夜。用200uL/孔测定稀释液封闭板。将培养上清液和标准品添加到适当的包被孔中，并在室温下孵育2小时。温育后将板用洗涤缓冲液彻底洗涤五次。将一百微升检测溶液添加到每个孔中。将板密封，然后在室温下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液将板彻底洗涤五次。向每个孔中加入一百微升四甲基联苯胺底物溶液，并将板在室温下于黑暗中孵育30分钟。五十微升终止溶液，然后加入到每个孔中。使用酶标仪在450nm下测量色密度。
　　 将C6细胞铺板在12孔板中，并在37°C下孵育24小时。经过指定的处理后，将细胞置于放射免疫沉淀裂解缓冲液中即可产生裂解液。进行Bradford分析以确定总蛋白浓度，所有样品均标准化为1千克每毫升。然后在样品缓冲液中制备样品，并加热至95℃5分钟。用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离等量的裂解液，然后将其电转移到硝酸纤维素膜上。凝胶以恒定电流运行3至4小时，以实现最大分离。使用预浸在甲醇中的聚乙烯二氟乙烯膜在恒流下进行1小时湿转移。将膜在0.2％PBST中的5％牛奶中封闭。然后将膜在PBST中洗涤3次，每次15分钟。用一抗在4℃孵育过夜后，将印迹洗涤并暴露于与HRP偶联的二抗1小时。然后使用化学发光检测来检测每种蛋白质的表达。GAPDH水平用作内部加载控件。使用SPSS19.0统计软件进行统计分析。所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±SD。使用单向方差分析确定P值。显着性定义为P小于.05。
　　 为了观察LPS对细胞生存力的影响，将不同浓度的LPS加入C6细胞培养的96孔板中，共培养24小时，然后进行MTT分析。为了评估C6胶质瘤细胞中LPS诱导的炎症反应，测量了炎症细胞因子的水平。发现不同浓度的LPS可以刺激C6神经胶质细胞培养上清中TNF-a含量的增加，并以浓度依赖性方式释放LPS。10ug每毫升组的增幅最大。此外，LPS还诱导C6-神经胶质瘤细胞中IL-1B水平显着增加。向含有C6-神经胶质瘤细胞的培养植物中添加了不同浓度的LPS，并连续培养24小时，然后使用蛋白质印迹法检测Akt磷酸化的表达水平。结果显示，与对照组相比，所有浓度的LPS均可下调磷酸化Akt的表达水平，而10ug每毫升的LPS则显示最显着的效果。上述研究方法，检测到不同浓度的多塞平C6细胞。结果表明，多虑平的所有浓度与上调对照组相比磷酸化Akt的表达，并且效果是最显着的多虑平时的浓度为10-7uM。
　　 此外，为进一步探讨多塞平对LPS诱导的C6细胞的抗炎作用是否由PI3K/Akt信号通路介导，选择特异性PI3Ka/δ/B抑制剂LY294002作为阻断剂，以进一步分析其变化。多塞平抗炎作用中的p-Akt水平。还发现LPS可明显降低磷酸化Akt的C6细胞的水平，多虑平抑制由LPS诱导的磷酸化Akt水平的降低。此外，在LY294002处理后，PI3K抑制剂LY294002显着阻断了多塞平对C6细胞的作用。显然，多塞平通过PI3K介导的途径促进了Akt激酶的磷酸化激活。总而言之，结果进一步证实多塞平可以通过PI3K介导的途径在C6细胞中显着诱导Akt的磷酸化激活。LPS可能会抑制P‐Akt的激活。P小于.05，与对照组相比；多虑平能明显阻断P-Akt的由LPS诱导的抑制作用。P小于0.01，与LPS组相比;此外，选择性PI3K抑制剂LY294002可以显着抑制多塞平诱导的P‐Akt的活化。P小于0.01，与多塞平组相比；在相同条件下重复实验3次。
　　 添加不同浓度的多塞平为含有C6神经胶质瘤细胞和连续培养24小时培养植物，然后加入LPS终浓度为10ug每毫升，再共培养24小时；测量炎症细胞因子的水平。出国看病网研究人员发现，多虑平能明显抑制在C6细胞LPS诱导炎症因子的表达，和多塞平在10浓度-7uM显示出最显著效果。为了阐明多塞平是否通过PI3K/Akt信号通路调节C6细胞中LPS诱导的炎症反应，选择PI3K特异性抑制剂LY294002作为阻断剂。在本实验中，将C6细胞分为四组：第一组为空白对照组，加入等量的1X磷酸盐缓冲盐水；第二组为LPS组，LPS终浓度为10ug每毫升；第三组为多塞平组，在多塞平中以10-7uM的浓度对C6神经胶质细胞进行预处理24小时，然后添加浓度为10ug每毫升的LPS共刺激24小时；第四组为LY治疗组，首先添加LY抑制剂1小时，然后添加多塞平至终浓度10-7uM并共培养24小时，然后添加浓度为10ug每毫升的LPS，以再刺激24小时。处理后，通过ELISA检测上清液中炎症因子的表达。与空白组相比，在其他三组炎性因子的表达不同程度的增加，和炎性因子的多虑平组中的表达高于LPS组显著降低。LY预处理后，治疗组中炎症因子的表达明显高于多塞平组。结果表明，多塞平介导的炎性因子表达的抑制作用被PI3K/Akt信号通路显着阻断。
　　 神经退行性疾病是中枢神经系统的一组慢性，进行性和退行性疾病，导致一类疾病。神经炎症可能与神经退行性疾病的许多发病机理和进展有关。中枢神经系统炎症的发展和进展主要是由先天免疫细胞引起的。在先前的炎症相关研究中，大多数研究主要集中在小胶质细胞上。然而，星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的神经胶质细胞类型和发挥炎症调控中枢轴重要的作用。研究表明，星形胶质细胞具有重要的分泌和免疫功能。它可以分泌20多种细胞因子，包括神经生长因子和其他炎症因子。TNF-a是众所周知的，其抗肿瘤作用和相关的炎症过程，始终起着神经炎症中起关键作用。IL-1B似乎炎症的网守，IL-1B介导的疾病通常被称为“自动炎症”和主导的发现是通过作用于单核细胞的内源分子从动IL-1B的活性形式的释放。近年来，星形胶质细胞与神经退行性疾病之间的关系受到更多关注。此外，多种星形胶质细胞表面表达清道夫受体，并且配体结合可以激活星形胶质细胞和多种炎症相关的信号通路。
　　 C6细胞是大鼠胶质瘤来源的克隆，已广泛用于神经系统疾病的病理研究和药物筛选，尤其是在神经炎性研究中。LPS也称为内毒素，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，是细胞实验中常见的炎症诱导剂。LPS诱导的C6细胞神经炎症模型被认为是经典的炎症模型。在研究中利用C6胶质细胞作为体外模型，发现LPS可以刺激C6细胞中炎性细胞因子的分泌。从1950年代后期开始，TCA被广泛用于治疗抑郁症。TCA的主要药理机制是抑制中枢神经系统中5-羟色胺的再摄取。其抗抑郁药治疗主要基于单胺假说。然而临床发现也表明，单胺假说不能解释抑郁症的所有症状。最近的文献表明，抑郁症可以影响炎症因子的释放。抑郁症与炎症相关疾病的患病率较高，因此，一些学者提出了抑郁症的炎症假设。同时研究人员考虑TCA是否具有抗炎作用。最近也有文献显示某些TCA可以下调海马神经元中凋亡蛋白的表达，并上调海马神经元中的神经营养基因，从而可以保护神经元。通过多系统萎缩转基因小鼠模型，发现几种TCA具有抗炎作用，并可以减少C6神经胶质细胞模型中IL-1B的释放。这些结果表明，TCA通常可能对CNS具有抗炎作用。
　　 多塞平已在临床中广泛用作三氯乙酸。以前的研究表明，多塞平除具有抗抑郁作用外，还具有抗氧化作用。通过动物实验发现，慢性应激可导致大鼠海马组织中TNF-a含量增加，这表明应激可能通过炎症引起记忆障碍，而低剂量的多塞平可能有助于通过减少炎症来抵抗这一过程。TNF-a的释放。先前的研究表明多塞平与PD患者的疲劳改善有关，另外研究表明，多塞平和非药物治疗可大大改善PD的失眠。但是，在某些动物实验中，多塞平没有显示出明显的神经保护作用。因此，作为一种常见的三氯乙酸，多塞平的抗炎作用需要进一步研究。出国看病网研究人员的实验表明多塞平明显抑制LPS诱导的C6细胞炎症，这表明多塞平可能以浓度依赖的方式对炎症反应具有保护作用。但是，多塞平介导的抗炎途径仍需进一步研究。
　　 到目前为止，多塞平抗炎保护作用的分子药理机制尚不清楚。据报道，Akt途径是众多促炎基因表达的主要参与者。很少有报道表明，LPS对Akt信号通路的激活可以诱导促炎细胞因子的释放，动物实验表明，LPS在大鼠中并未显着激活Akt磷酸化。但在实验的前部，出国看病网研究人员发现LPS可能下调C6细胞中p-Akt的表达。同时发现doxepin可能上调p-Akt的表达。也许，细胞类型和培养环境的差异可能导致不同的结果。最近研究表明，LPS诱导可以增加PTEN表达，而PTEN是PI3K/Akt信号通路最重要的负调节剂。这样做的理由矛盾的结果需要进一步研究。因此，支持多西平的保护作用可能与PI3K/Akt信号通路有关的假设。PI3K/Akt信号通路已被广泛研究。它广泛分布在各种神经细胞中，是膜受体将信号转导到细胞中的重要途径。不仅可以调节细胞增殖，代谢，分化和抗凋亡，还可以调节神经系统的炎症功能。先前的研究表明，PI3K/Akt信号通路与神经系统的炎症密切相关，而PI3K/Akt信号通路的激活可以抑制炎性细胞增殖并减少炎性因子的释放。最近的研究表明，PI3K/Akt信号传导途径可能是炎症反应的上游调节途径。可能调节核因子-κB信号通路并激活下游蛋白，从而调节炎症反应。在脑血管疾病，神经退行性疾病，脱髓鞘疾病，运动障碍，癫痫病和神经肌肉疾病等神经系统疾病中，PI3K/Akt信号通路目前受到研究人员的越来越多的关注，并经常用于发病机制研究中，治疗药物的研发。
　　 在这项研究中，PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂LY294002被用作阻滞剂，发现LY可以抑制多塞平的抗炎作用。因此，出国看病网研究人员可能进一步推测多塞平在抗LPS诱导的C6神经胶质炎性反应中的作用可能与PI3K/Akt信号通路密切相关。Doxepin可能通过激活PI3K/Akt信号通路来激活Akt的磷酸化，并增加P-Akt的含量以发挥抗炎作用。这些结果凸显了多塞平对神经炎相关疾病的潜在作用。综上所述，发现多塞平预处理可以抑制LPS诱导的C6-胶质瘤细胞炎症，但是这种作用可以被PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂LY294002阻断。同时发现LPS可以降低C6胶质细胞中P‐Akt的表达，而多塞平预处理可以抑制这种作用。因此，出国看病网研究人员可以推测多虑平可能通过激活PI3K/Akt信号通路，激活Akt磷酸化和上调P‐Akt的表达来发挥作用，从而产生神经官能症炎症的保护作用，PI3K/Akt的C6细胞炎症信号通路在多塞平诱导的对LPS的抗性中起关键作用。但是，尚不清楚doxepinPI3K/Akt信号传导途径的激活和抗炎作用的下游分子机制。