胶质母细胞瘤是WHO的IV级胶质瘤。尽管在手术和放化疗的进步，GBM患者的平均存活时间在最近几年变化不大。因此，阐明GBM的发展机制并确定这种无法治愈的癌症的分子靶标至关重要。S100蛋白是属于EF手钙结合蛋白家族的低分子量蛋白，仅在脊椎动物中表达。S100A11是S100蛋白质的成员。S100A11在人类角质形成细胞的生长调节中起着不同的作用，因为它可以通过增强表皮生长因子蛋白的活性来抑制Ca2+诱导的生长并刺激生长。S100A11在许多癌症，例如乳头状甲状腺癌，结肠癌，胰腺癌和卵巢癌中过表达。但是，S100A11在GBM中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在分析S100A11在GBM中的功能和机制。膜联蛋白A2属于膜联蛋白家族，是一种钙依赖性磷脂结合蛋白。ANXA2在包括神经胶质瘤在内的许多肿瘤中过表达异常，ANXA2的表达通过调节细胞增殖，凋亡，侵袭和转移在肿瘤发展的重要作用。
　　 在这项研究中，调查了S100A11在GBM致瘤性中的作用，尤其是GBM细胞增殖，上皮-间质转化，迁移，侵袭和通过沉默或过度表达GBM形成神经球。证据表明S100A11通过ANXA2介导的NF-κB信号通路促进GBM的发展和进程。从癌症基因组图谱数据库获得S100家族表达数据的分析。S100家族表达与TCGA中GBM患者总体生存的相关性可从基因表达谱交互式分析获得。胶质母细胞瘤组织和非肿瘤性脑组织由医院提供。NBT是从脑部受伤后接受手术的患者获得的。每位患者均获得书面知情同意。
　　 GBM细胞系U251，U87，LN229，U118，A172和T98从上海细胞库购买。胶质母细胞瘤细胞在含10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。为了诱导神经胶质瘤干细胞分化，将GSC分离并在补充有N2，B27、3mML-谷氨酰胺和5％FBS的神经基础培养基中培养。为了在U251细胞中过表达S100A11，将S100A11的基因插入pWPXLd-puro质粒中以表达-S100A11融合蛋白。为了使U87细胞中的S100A11沉默，将短发夹RNA亚克隆到pLV-puro质粒中。将细胞接种在96孔板中，然后在50uMEdU中染色4小时。细胞用4％多聚甲醛固定并用0.5％TritonX-100透化。洗涤三次后，用磷酸盐缓冲盐水，将细胞用100uL的1×阿波罗反应。不清楚的部分用DAPI染色，并在荧光显微镜下拍照。胶质母细胞瘤细胞接种在6孔培养板中。大约15天后，将细胞在甲醇中固定20分钟，然后染色0.1％的结晶紫溶液。用数码相机照相这些板。
　　 将细胞添加到在无血清DMEM中预先涂有Matrigel的小室顶部，并将具有10％FBS的DMEM培养基添加到下小室中。培养36小时后，将侵袭的细胞用甲醇固定并用0.3％结晶紫溶液染色。每个孔用显微镜随机照相。细胞在6孔板中培养，并汇合至95％。线性伤口是由塑料移液器尖端造成的。然后在0或48小时下在显微镜下拍摄线性伤口。如先前所述进行3D迁移测定。如前所述进行流式细胞术测定。使用碘化丙啶染色确定细胞周期分布。在膜联蛋白VPI染色后确定凋亡细胞的百分比。首先检查S100家族在GBM从TCGA数据库的表达，S100A2，S100A3，S100A6，S100A10，S100A11，S100A16和S100PBP均GBM组织上调与NBTs。然后，通过将这些上调的S100蛋白表达与GBM患者的总体生存率相关联，仅高水平的S100A11是GBM患者总体生存率低的预后因素。另外通过免疫组织化学和蛋白质印迹检查了GBM中S100A11的表达。免疫组织化学在GBM组织和NBT玻片上进行。蛋白质印迹结果表明，与NBT相比，GBM样品中的S100A11上调。
　　 然后，通过蛋白质印迹检测了S100A11在不同GBM细胞系中的表达。S100A11蛋白水平在U87细胞中较高，而在U251细胞中较低；因此，下调了U87中的S100A11，并上调了U251中的S100A11。用针对S100A11的抗体进行蛋白质印迹分析的结果证实了U100细胞中S100A11的敲低和U251细胞中S100A11的过表达。使用CCK8，EdU和集落形成测定法来检测S100A11在GBM细胞增殖中的作用。在CCK8分析中，S100A11的下调显着抑制了U87细胞的增殖，其在U251细胞中的过表达表现出相反的作用。在EdU分析中，S100A11的下调显着降低了EdU阳性U87细胞的百分比，其在U251细胞中的过表达表现出相反的作用。与上述结果一致，克隆形成试验的结果表明，S100A11抑制作用减少了菌落的形成，而过表达S100A11则增加了菌落的形成。流式细胞仪分析表明，S100A11的沉默使GBM细胞停滞在G1期，而S100A11的过表达导致S期的细胞更多，而G1期的细胞更少。先前的研究报告称，CyclinD1和CyclinE1与G1逮捕有关，海外医疗网报道了敲低S100A11会降低CyclinD1和CyclinE1的表达水平。AnnexinVPI流式细胞仪分析显示，敲除的S100A11在早期凋亡细胞中增加。击倒S100A11可增加促凋亡蛋白表达，并降低抗凋亡蛋白表达。这些结果表明S100A11促进了GBM细胞增殖。
　　 我们确定S100A11对GBM细胞中EMT的作用。结果显示，在敲低的S100A11U87细胞中，波形蛋白，纤连蛋白和N-钙黏着蛋白的蛋白水平下调，而E-钙黏着蛋白的蛋白水平上调，在U251细胞中的过表达表现出相反的作用。U87细胞中S100A11的下调减少了侵袭细胞的数量。S100A11在U251细胞中的过表达产生相反的结果。在伤口愈合试验中，S100A11沉默的U87细胞在48小时时的迁移细胞数量显着减少。S100A11在U251细胞中的过表达产生相反的结果。同时，S100A11下调抑制了3D胶原基质中的细胞浸润，与对照细胞相比，S100A11下调的细胞显示出较少的迁移形态。S251A11在U251细胞中的过表达产生相反的结果。因此，S100A11促进GBM细胞EMT，迁移和侵袭。
　　 我们测试了S100A11是否与神经胶质瘤干细胞相关。通过悬浮培养，U87和U251细胞系被用来获得可能丰富GSC的神经球。我们观察到，与粘附的GBM细胞相比，神经球中的S100A11蛋白水平显着增加。免疫荧光染色表明，GSC标记在U87和U251神经球中表达。击倒S100A11会显着降低GSC标记物表达。同时，S100A11的过表达产生相反的结果。通过进行有限稀释测定，显示出S100A11促进了神经球形成的GBM细胞。尝试在GBM中搜索S100A11的机制。膜联蛋白和S100蛋白是两个大但独特的钙结合蛋白家族。S100蛋白可以与某些膜联蛋白相互作用，例如ANXA1和ANXA2。Ca2+可以触发S100A11-ANXA2交互。ANXA2促进神经胶质瘤细胞侵袭和肿瘤进展。由于这些原因，建议S100A11促进GBM的发展和进步可能与ANXA2相关。首先，通过蛋白质印迹检查了GBM细胞和组织中ANXA2的蛋白表达。结果表明，ANXA2在GBM细胞上调与正常人星形细胞进行比较和上调GBM组织与nontumourous人脑组织相比。然后在20个GBM标本中进行了S100A11和ANXA2的免疫组织化学染色。蛋白质印迹显示，当抑制S100A11时，ANXA2的蛋白水平降低，而当S100A11过表达时，ANXA2的蛋白水平升高。ANXA2降解受多泛素调节。S100A11诱导的ANXA2的敲低是否通过泛素-蛋白酶体途径减少。为了检测蛋白酶体在ANXA2降解中的作用，用sh-S100A11-1，sh-S100A11-2或shCtrl转染U87细胞，并用蛋白酶体抑制剂MG132处理。结果表明，用MG132处理后，在敲低的S100A11细胞中ANXA2有所增加。此外，在敲低S100A11后，ANXA2的蛋白质半衰期缩短了。在U87和U251细胞中使用coip进行S100A11和ANXA2之间的相互作用。更重要的是，敲低S100A11可以增加多泛素化Myc-ANXA2的数量。相反，在S100A11上调的细胞中，ANXA2的泛素化程度降低了。
　　 NF-κB与许多癌症的进展密切相关。ANXA2密切与NF-kB的途径有关。检测到的NF-κB信号传导是否参与了GBMS100A11信令。首先，在下调和上调的S100A11GBM细胞中检测了IKKα和p65的总和和磷酸化水平，以及IκBα表达的总水平。与对照细胞相比，在下调或上调的S100A11GBM细胞中，p65的表达没有变化。然而，蛋白质印迹和免疫荧光的结果表明，与对照细胞相比，击倒的S100A11U87细胞的p65表达水平在胞质中被诱导而在核中降低。过表达S100A11产生相反的结果。此外，ANXA2的过表达挽救了被敲低的S100A11抑制的NF-κB活化。而且，p65是经典的转录因子。接下来，确定p65是否可以在转录水平上调控S100A11。P65抑制作用显着降低GBM细胞中的S100A11mRNA水平。通过JASPAR数据库扫描S100A11启动子区域，我发现一个推定的S100A11结合位点。为了检查p65与启动子区域中结合位点的内源性结合，进行ChIP分析，发现p65确实结合了该位点，但未结合到S100A11的编码区）。因此，证明S100A11通过ANXA2激活了NF-κB途径，并且NF-κB在转录水平上调节了S100A11。
　　 使用U87原位异种移植模型评估S100A11在体内的作用。体内成像系统显示，用sh‐S100A11转染的U87细胞与其对照相比，带有sh‐S100A11转染的U87细胞的小鼠与异种移植相比，肿瘤体积显着减少用shCtrl转染。在存活曲线中，与shCtrl移植的异种移植相比，sh-S100A11移植的异种移植显示出显着提高的存活率。而且，重要的蛋白质，例如S100A11，ANXA2和NF-κB信号蛋白，被GBM异种移植物中的S100A11下调显着抑制。S100A11是在人体组织中广泛表达的S100蛋白之一。具有双重功能：对不同类型的肿瘤起抑癌或促癌作用。在角质形成细胞中，S100A11和SMAD异源复合物的磷酸化使Sp1蛋白在细胞核中结合在一起。在自由Sp1的蛋白质的减少诱导p21和抑制DNA合成。因此，S100A11充当了肿瘤抑制因子。还可以刺激人胰腺癌细胞的增殖，并促进胰腺癌细胞的G1相转变，卵巢癌细胞的生长和侵袭以及肺癌细胞的生长。然而，尚未在GBM中报道S100A11，并且尚不清楚S100A11在人GBM中的功能分子机制。
　　 在这项研究中，显示GBM中S100A11上调，而S100A11与患者生存不良呈正相关。S100A11增强了GBM细胞的增殖，EMT，迁移，侵袭和神经球形成。综上所述，S100A11的高表达是重要的致癌因子，在GBM的发生发展中起着至关重要的作用。S100A11促进GBM发生和发展的分子机制尚不清楚。ANXA2是钙依赖性磷脂结合蛋白。33ANXA2在各种肿瘤中过表达，包括乳腺癌，胰腺癌，ESCC和神经胶质瘤，它们通过调节细胞生长，凋亡，侵袭和肿瘤新血管形成在肿瘤进展中发挥重要作用。钙可以触发修复细胞膜中的S100A11-ANXA2相互作用。S100A11可能与ANXA2相互作用以促进GBM的进展。这项研究表明，S100A11可以与ANXA2相互作用并稳定GBM细胞中的ANXA2。S100A11可以通过减少ANXA2泛素化和蛋白酶体降解来稳定ANXA2。
　　 NF-κB信号传导与许多细胞反应有关，例如细胞存活，分化和增殖。NF-κB信号已被报道在恶性细胞移动性的重要作用。研究表明ANXA2可介导的NF-κB的上调。S100A11可能通过调节ANXA2介导的NF-κB途径来促进GBM进程。在这里，证明S100A11的降低可降低p-Ikkα和p-p65的水平，并增加IκBα。另外，与对照细胞相比，在击倒的S100A11细胞的细胞质中诱导了p65表达水平，并且在核仁中降低了p65表达水平。表达S100A11具有相反的效果。在S100A11沉默的GBM细胞中过表达的ANXA2可以有效拯救NF-κB信号通路的激活。更重要的是，NF-κB-p65可以在转录水平上调节S100A11作为阳性反馈。因此，通过激活ANXA2介导的NF-κB信号通路，GBM细胞中S100A11的表达增加可以促进GBM细胞增殖，EMT，迁移，侵袭和神经球形成。
　　 总之，结果表明S100A11在GBM细胞的增殖，EMT，迁移，侵袭和神经球形成中起着关键作用，并与GBM患者的不良存活率相关。此外，功能和机制研究表明，GBM细胞中的S100A11正反馈回路促进GBM的进展。S100A11可能是开发抗肿瘤药物的潜在目标。