有效的毒性较小的恶性小儿脑肿瘤疗法代表了尚未满足的临床需求。与儿童期脑癌相关的高发病率和死亡率，是由于目前的治疗方法在发育中的大脑内引起的神经毒性所致。需要针对肿瘤细胞的新型靶向疗法，以改善脑癌患儿的预后并减少其有害的副作用。溶瘤性单纯疱疹病毒治疗为治疗小儿脑肿瘤提供了一种创新的，针对性的毒性较小的方法。机构已进行了3个第1个阶段的第一代oHSV，其具有Y的两个拷贝的试验34.5删除和lacZ启动在复发性高级别神经胶质瘤成人中单独或单次小剂量放疗，可将其插入核糖核苷酸还原酶基因座中以增强保护。这些试验最终证明了将高剂量最多3×109噬菌斑形成单位]直接注射到肿瘤或周围脑组织中的安全性，大约50％的患者具有影像学证据表明有肿瘤反应，包括两名长期幸存者。
　　 临床前数据表明，儿童可能是oHSV的理想人选。最近报道与8例成人患者来源的胶质母细胞瘤异种移植相比，10例儿科患者来源的脑肿瘤异种移植物对oHSV杀伤的敏感性平均高出40倍。此外，小儿髓母细胞瘤肿瘤细胞以及化学耐药和放射耐药的CD133+或CD15+癌症干细胞对oHSV高度敏感，而CD133+胶质瘤细胞同样敏感，没有固有的耐药性到oHSV。根据临床前研究结果对患有复发性或进行性恶性幕上肌瘤和小脑肿瘤的儿童进行单独G207或单次5Gy剂量放射治疗的正在进行的临床试验。以最大限度地提高oHSV，实现更持久响应的关键障碍正在制定一项战略，以扩大并维持由病毒引起的抗肿瘤免疫反应。人脑肿瘤通过“检查点”蛋白质逃避了免疫监视，这些蛋白质可以抑制肿瘤浸润的淋巴细胞并阻止T细胞活化。这些蛋白质在脑肿瘤中的较高表达与患者预后差有关，用检查点抑制剂阻断这些蛋白质已导致某些人类癌症发生剧烈反应。然而，煽动和维持一个有效的抗肿瘤免疫反应显著的挑战仍然是大脑的免疫特权网站。为了最大程度地提高oHSV的抗肿瘤免疫应答，开发了一种创新的多重生物标志物筛选平台，该平台能够评估在局部和浸润的免疫细胞类型中的地形位置，结构分布和功能状态的变化。输注G207后在最终的肿瘤/免疫病理学中的作用。多重免疫荧光技术的最新进展已允许在福尔马林固定，石蜡包埋的组织上同时可视化一小组抗原，以进行疾病诊断和翻译研究。在这描述新方法可同时显示突出神经炎症反应，免疫检查点状态，肿瘤表型和血管生境的抗原标签。应用该技术研究G207病毒治疗后小儿GBM患者的治疗反应。所获得的结果将通过鉴定佐剂靶标来最大程度地发挥功效，从而为下一系列小儿病毒疗法临床试验提供参考。
　　 根据方案从一名11岁女性右顶叶成胶质细胞瘤的治疗前的活检组织中获取，以确认复发的肿瘤。输注G207约3个月后，在肿瘤切除过程中获得了来自同一患者的治疗后HSV组织。阿拉巴马大学伯明翰大学机构审查委员会审查并批准了该试验和研究；以下描述的研究是根据卫生与公共服务部批准的“合规保证”进行的。在进行治疗筛查之前，先从患者的父母那里获得知情同意，并从患者那里获得同意。在放置导管之前进行活检以确认肿瘤组织的存在。冷冻切片显示复发性肿瘤后，将3个硅橡胶导管放置在肿瘤的立体定位预定义坐标中。G207治疗之前和之后的脑肿瘤组织块均固定在10％中性福尔马林缓冲液中，并经过标准临床处理后制成石蜡块。在35°C连续脱水70％，80％，90％和3次无水酒精后，将组织块在在相同的温度下进行2次二甲苯溶液的更换，并通过4个单独的石蜡浴在58°C下转移。最后将组织块包埋在石蜡中，以5um的厚度切片，用于多重荧光免疫组织化学。
　　 从福尔马林固定，石蜡包埋的块制剂中获得4um切片。免疫染色用全自动免疫染色仪完成。使用来自LeicaBiosystems的针对CD3，CD4，CD8和CD68的即用型抗体进行临床免疫组织化学。制备适当的阳性和阴性对照玻片；阴性对照玻片由每个病例的组织切片组成，无需添加一抗即可处理。在经过HSV处理前后的GBM组织的5um厚石蜡切片上进行了多重荧光免疫组织化学分析，使用多达4个迭代循环的连续免疫染色，并选择针对特定抗体的深表型的精选抗体组。GBM的细胞结构和肿瘤微环境检查。通过荧光显微镜对每轮抗体染色进行成像，然后进行抗体剥离和组织固位步骤以重复该循环，每次使用不同的抗体组，最终最终筛选出每个组织切片中与GBM表型有关的18种不同的经过验证的生物标志物。首先使用标准的二甲苯与乙醇补液方案对切片进行脱蜡处理，然后在800mW，设置为100％的微波中，在10mMTris/EDTA缓冲液pH9.0中进行10分钟的热介导的抗原修复步骤，进行抗原脱膜。然后将切片与人BDFc封闭溶液孵育以饱和内源性Fc受体，在TrueBlackReagent中孵育以淬灭固有的组织自发荧光。
　　 然后在切片中使用1–5ug每毫升的针对神经炎性细胞表型的免疫兼容抗体面板的混合鸡尾酒对切片进行1小时免疫反应。此步骤之后，在补充有1千克每毫升牛血清白蛋白的PBS中洗掉多余的一抗，并使用1ug每毫升适当交叉吸收的二抗混合物对切片进行染色，与光谱兼容的荧光团之一偶联。洗去多余的二抗后，将切片用1ug每毫升DAPI复染，以观察细胞核。然后使用Immu-Mount培养基盖玻片，并使用多通道宽场落射荧光显微镜成像。成像后在RT中于剥离缓冲液中孵育5分钟后，将与组织结合的一抗和二抗都从载玻片上剥离，然后在Tris/EDTA缓冲液中进行1分钟的额外热介导抗原修复步骤。重复以上从人BDFc封闭溶液中组织的重新封闭开始的加工周期，然后使用靶向选择检查点蛋白的第二种抗体混合物孵育相同的切片。依次使用抗体组3和4将整个过程再重复两次，以分别表征GBM表型和血管位。使用配备非浸没物镜，高分辨率ORCA-Flash4.0的AxioImager.Z2滑动扫描荧光显微镜从整个标本切片采集图像sCMOS数码相机，200WX-Cite200DC宽带灯光源和7个定制的滤光片组经过优化，可检测荧光团。以0.325微米/像素的空间分辨率分别捕获图像块，并使用ZEN2图像采集和分析软件程序将这些块无缝地缝合成整个样本图像，适当的颜色表已应用于每个图像通道，以匹配其发射光谱或设置可区分的颜色平衡。然后将从所有4轮抗体染色和成像中获取的伪彩色缝合图像导出到AdobePhotoshop，并作为单独的图层覆盖，以创建彩色合并的复合材料，如前所述。
　　 由经过临床培训的神经病理学家对总共n=6个感兴趣的随机区域进行量化。通过DAPI阳性染色确定的每个ROI的核数大于等于100。数据表示为给定标记物阳性细胞占DAPI阳性细胞总数的百分比；所有统计测试均在GraphPadPrism中进行。使用D'Agostino和Pearson总体正态性检验测试数据的正态性，然后评估方差的均一性。通过两个检验的数据通过两尾未配对的学生t检验进行进一步分析。p值小于0.05被认为具有统计学意义。复杂的宿主-肿瘤关系是肿瘤细胞，正常实质，基质成分和免疫系统之间相互作用的结果。尽管这种公认的复杂性，一种能够对临床相关组织进行表型分型的综合方法尚未出现。在本文中成功地证明使用多种抗体分析临床组织样品的能力。ROI以糖蛋白A定义的出血为中心，PECAM-1/CD31和胶原蛋白IV定义的肿瘤脉管系统在预处理中充当组织的标志和后处理组织。对CD31的百分比进行定量阳性细胞无统计学差异。
　　 使用抗体组1，证明用oHSVG207处理后T淋巴细胞大量流入，如CD3，CD4和CD8表达所证明。在进行HSV治疗之前，在整个治疗前组织以及所检查的ROI内均缺乏适应性免疫。治疗后组织的检查显示整个组织中大量CD3+CD8+T细胞大量涌入，并且CD3的比例显着增加，CD4和CD8检查的ROI内的阳性细胞；尽管CD3+CD4+T细胞在治疗后确实增加，但绝大多数CD3+细胞是效应CD8+T细胞。此外，与治疗前组织相比，在治疗后组织中观察到更大比例的巨噬细胞和小胶质细胞，遍及整个组织和被检查的ROI内。使用代表性组织块上的标准临床免疫组织化学进一步证实了这些发现。值得注意的是，CD68的百分比大约增加了3倍，IBA1的百分比发现了阳性细胞。除溶瘤之外，数据表明oHSV疗法增加或放大了抗肿瘤免疫应答。
　　 抗体组2的分析使能够进一步表征治疗前后组织活检的免疫调节状态。鉴于上述T淋巴细胞大量涌入，试图表征其CTLA-4和PD-1的表达，具有相关临床价值的检查点蛋白，从而发现CTLA-4的比例显着增加和治疗后PD-1阳性淋巴细胞。注意到少数CD8+预处理样品中的T淋巴细胞表达CTLA-4，尽管表达较弱，而CTLA-4在处理后的CD8+细胞上普遍表达。此外，PD-1在治疗后的CD4+和CD8+细胞上均高表达。除了检查检查点蛋白的淋巴细胞表达外，还检查肿瘤细胞中PD-L1和IDO的表达。PD-L1表达用8.4％±0.9％的细胞是增加显著表达PD-L1与G207处理后p-值=0.001）。虽然微弱IDO表达在治疗前和治疗后的组织，有显著更多的细胞与治疗后。数据表明，尽管在oHSV后肿瘤有强烈的免疫细胞浸润，但在肿瘤细胞和免疫细胞中检查点蛋白表达同时增加。
　　 试图通过抗体组3来表征肿瘤细胞表型和整体复制。波形蛋白/nestin染色的强度在HSV治疗前和HSV处理后相对稳定，波形蛋白的百分比没有可检测到的差异或nestin阳性细胞。此外，未发现治疗前组织与治疗后组织中增殖细胞核抗原阳性细胞的比例有任何显着差异后值±4.9％，p值=0.531）。同样，在治疗前和治疗后组织中，GFAP的表达也没有显着差异。最后，出国看病网研究人员量化了S100B和SOX2阳性细胞的比例，发现S100B细胞的百分比增加了3倍，与治疗前相比，治疗后的SOX2阳性细胞显着减少。
　　 尽管有精密医学的吸引力，但基于患者个体肿瘤独特特征的能够成功治疗进行性小儿高级别神经胶质瘤的靶向疗法尚未实现。缺乏治疗选择与大量的研究工作和临床试验形成了鲜明的对比。如此大规模的研究投资取得了有限的成功，需要对儿科脑肿瘤的病理生物学进行重新评估，并随后完善治疗方法。新兴的免疫荧光方法有望为理解肿瘤微环境提供新的视角，使免疫细胞与肿瘤细胞之间的空间关系成为现实。因此，本文中已经在原位验证了新颖多重免疫荧光生物标志物筛选方法，并有效证明其在肿瘤免疫病理学和对病毒疗法反应的体系结构评估中的用途。同时鉴定出18种相关的生物标志物，这些标志物可反映血管的利基，炎症，复制，干性和神经胶质分化，从而全面表征此类脑肿瘤的发病机理/生物学特性并最终开发出治疗方式。例如oHSV治疗后检查点蛋白的高表达确定了检查点蛋白抑制剂治疗以维持抗肿瘤免疫应答的丰富靶点。
　　 除选择性杀死肿瘤细胞外，oHSV还可触发抗肿瘤免疫反应。这可能通过几种机制发生：溶瘤细胞死亡后肿瘤新抗原的释放；刺激抗病毒免疫反应；抑制肿瘤的免疫逃逸机制；工程化的促炎细胞因子的表达。在这项前瞻性研究中，直接观察由oHSV治疗的小儿GBM患者激活的细胞毒性T细胞应答的时空特性。显示在治疗后约90天，在血管壁附近感兴趣的关注区域中强大的肿瘤浸润。此外，发现小胶质细胞和巨噬细胞显着增加。这可能与S100B的增加有关，S100B的增加已被证明可作为巨噬细胞的化学吸引剂。确定CTLA-4+PD-1+T细胞群体的强劲浸润，并且肿瘤细胞表现出PD-L1和IDO的上调。癌症免疫治疗策略，包括CTLA-4阻断，PD-1/PD-L1抑制或IDO抑制，激活了细胞介导的针对肿瘤细胞的免疫反应。用oHSV处理后，CTLA-4和PD-1在细胞毒性T细胞上的表达以及PD-L1和IDO在肿瘤细胞上的表达表明溶瘤病毒治疗和检查点抑制剂之间具有协同作用的潜力。
　　 此类工作为全面描述CNS肿瘤病理学奠定了基础，并且最终可能扩展到其他疾病/疾病或对CNS的侮辱，这些疾病或损伤需要对损伤或疾病的组织反应进行全面了解。谨慎地注意，多次IHC染色的迭代轮次可能最终将每个组织切片的筛选生物标志物数量增加到数百甚至数千，这可能随着自动化程度的提高而在更广泛的临床规模使用中变得可行。当前，正在通过开发经过验证的抗体的新型组合来扩展出国看病网研究人员的生物标志物，这些抗体能够完全表征脑肿瘤组织的复杂反应和对实验疗法的反应。进一步，正在开发更高级的计算解决方案，这些解决方案将采用针对出国看病网研究人员的成像范例定制的机器学习算法，从而最终实现轻松可扩展的图像数据分析，以支持系统生物学和转化研究，以设计出最佳的治疗策略，以减轻神经系统疾病/疾病的负担。或侮辱性侮辱。计算的进步与未来样品制备的机械自动化相结合，可以改善这种方法的可扩展性，因此可以在病毒疗法或其他免疫疗法后常规对监测治疗反应的患者进行常规治疗。增加出国看病网研究人员的原位应用多重免疫荧光还将促进对病毒治疗的免疫和肿瘤细胞反应范围的更好理解，并且与临床相关性将为患者分层和监测对治疗的反应提供生物学见解。
　　 总而言之，新颖的原位多重免疫荧光筛选方法和成像平台是一种有用的方法，能够提供对肿瘤细胞结构中发生的复杂变化的全面分析，特别是在以免疫学为中心的治疗后。综上所述，结果表明多重生物标志物筛选平台为全面表征中枢神经系统肿瘤治疗前后大脑中发生的变化奠定了基础。