如今，在神经胶质瘤进展肿瘤微环境的重要性已逐渐重视。着眼于肿瘤微环境中，例如靶免疫细胞疗法和目标血管治疗的疗法已被引入到神经胶质瘤的治疗的军火库。肿瘤细胞代谢有其独特的特征，并且比正常细胞更剧烈的。神经胶质瘤中的肿瘤细胞代谢也已被用作神经胶质瘤中的新治疗靶标。脑胶质瘤是异质的，具有多细胞相互作用，这确定了肿瘤的微环境和新陈代谢不是相互隔离的，而是它们相互相互作用，共同为肿瘤的生长和恶性进展创造了有利的条件。大量的临床和临床前研究提供了充足的证据，与对方和定位方面都与微环境的相互作用的代谢已经被证明更有效和全面的神经胶质瘤治疗。结果，结合检测和升高肿瘤细胞代谢和肿瘤微环境可以更好地了解神经胶质瘤的进展。尽管具有重要意义，但由于缺乏有效的无标记方法，胶质瘤中的肿瘤微环境与肿瘤细胞代谢之间的复杂关系尚未得到完全认识。
　　 为了解决这个问题，已经开发了多种技术来更好地评估神经胶质瘤中的肿瘤微环境和肿瘤细胞代谢。其中，光学技术是最有前途的。可以直接提供生物学信息的显微分光光度计和荧光光谱法已被证明能够在多种应用中无标记地估算肿瘤代谢。到目前为止，关于人脑肿瘤的评估工作还很少。使用微量分光光度计通过分析光学氧化还原比，NADH和自发荧光发射光谱的FAD强度，对健康的大脑和神经胶质瘤组织的体内和体外代谢进行评估。使用荧光光谱通过分析光学氧化还原比，NADH和自发荧光发射光谱的FAD强度来评估福尔马林固定的脑肿瘤和邻近正常样品上的肿瘤细胞代谢。尽管显微分光光度计和荧光光谱法可以无标记地评估肿瘤细胞的新陈代谢，但是由于缺乏空间分辨率，该方法无法解析组织的微环境微观结构。作为一种功能更强大的光学工具，基于二次谐波产生和双光子激发荧光的多光子显微镜被认为是一种高分辨率，无标记的成像工具，吸引了许多因为它的注意力被开发。MPM可以记录被视为内源性荧光团的特定“指纹”的荧光光谱，并提供洞察力来了解复杂生物系统中的肿瘤细胞代谢和生化信息。MPM具有穿过检查固有荧光发色团以产生具有标准组织学的可比的详细信息的图像，并在优越采样深度具有固有的三维切片和没有光漂白或光损伤的风险的能力。
　　 由于其可以提供的组织学结构特异性和定量生化信息，MPM特别适合于研究未染色的组织。直到现在，MPM主要集中在组织解剖结构和宏观组织特性，从而创建图像，就像在伊红染色的组织学。仅少数出版物报道了胶质瘤中肿瘤微环境的成像和肿瘤代谢的特征。Mehidine和Fanny使用次谐波生成成像和双光子成像来描绘脑组织的微观结构。同时采用光谱分析，两个光子荧光寿命成像显微镜分析以NADH，FAD，脂质，氧化还原比和光学指数比为特征的肿瘤代谢。然而，在单细胞水平，如单淋巴细胞和血管细结构的微环境细节尚未明确提出大规模。在本研究中，为了定性和定量地评估神经胶质瘤中的肿瘤微环境和肿瘤代谢，首先对肿瘤微环境的形态特征成像。MPM图像清楚地揭示了微环境的细节，包括胶原蛋白，淋巴细胞和血管。接下来，已经开发了几种新颖的成像算法来自动定位胶原蛋白，淋巴细胞和血管。同时，可以自动计算胶原蛋白含量，血管数目和淋巴细胞含量以及淋巴细胞和肿瘤细胞的亮度，以定量描述神经胶质瘤中肿瘤微环境的形态特征。最后，通过研究光学氧化还原比，NADH和FAD荧光发射光谱的强度来评估代谢活性。
　　 2015年至2018年，人脑胶质瘤组织和正常脑组织在进行调查，切开组织后，将标本放入标准病理运输容器中，然后在30分钟内交付到病理实验室。将每个样品置于-20°C的最佳切割温度化合物中，直到用LeicaCM3050冷冻切片机连续切片。用H＆E对厚约5μm的中层冷冻切片进行H＆E染色以进行组织学检查，并将剩余的20μm厚的新鲜透明切片用于多光子显微镜成像。在多光子显微成像过程中，将这些新鲜的切片切片用少量磷酸盐缓冲盐水溶液灌注，以防止脱水或收缩。然后，将盖玻片放在PBS润湿的样品上，以进行多光子显微成像。
　　 在研究人员的实验中，开发了三个自定义程序来自动计数胶原蛋白含量，淋巴细胞含量，血管数量，淋巴细胞含量以及淋巴细胞和肿瘤细胞的亮度。这些定制的程序在MATLABImageProcessingToolbox中用于分割和分析MPM图像。为了计算细胞外基质中胶原蛋白的密度，MPM图像经过以下算法：首先，原始RGB图像的绿色像素值随着距离的增加而增强。绿色像素值被认为是抑制背景的高斯函数的输入变量。下一个，通过Otsu阈值分割将增强后的结果分为8位灰度图像，分为胶原和非胶原区域，然后应用数学形态学处理进一步去除噪声。最后，获得胶原蛋白的分割结果，并根据胶原蛋白的占据面积计算出胶原蛋白的密度。为了计算淋巴细胞和肿瘤细胞的淋巴细胞密度以及亮度，对MPM图像进行了以下算法处理：首先，将原始RGB图像转换为LAB颜色空间，仅获取包含强度信息的亮度分量。其次，将亮度分量进一步更改为灰度图像，以去除噪点和杂质区域。第三，使用模糊C均值聚类分割来获得粗糙的淋巴细胞-肿瘤边界。第四，进行图切割分割以获得更多的价格边界。最后，白线画出了淋巴细胞和肿瘤细胞之间的边界。
　　 为了计算该容器数，通过以下算法处理MPM图像：首先，将基于RGB颜色空间的原始图像转换为LAB颜色空间，仅获取图像的亮度分量，然后增强亮度分量以增强血管。接下来，通过高斯滤波器执行增强效果以去除噪声，然后使用Otsu阈值分割获得血管区域。通过数学形态学处理获得粗糙血管边界分割。应用图割算法对粗糙血管边界进行分割得到了较好的分割结果。最后，用白线勾勒出血管边界。同时计算出血管数。因此，在细胞水平上监测代谢变化对于了解疾病的进展非常重要。在这项研究中，通过光学氧化还原比，NADH和FAD强度来表征代谢活性。通过MPM系统的λ模式获得NADH和FAD强度，以及基于荧光发射光谱的胶质瘤氧化还原率。为了获得相同考虑下的光谱图像，将激光激发波长设置为810nm，激光功率设置为8.5MW。每次还将所有系统参数设置为相同的值。同时，将来自同一患者的神经胶质瘤组织及其相邻的正常结构的脑组织冷冻在一起，然后切成相同的切片。
　　 肿瘤被视为动态的假器官，其中包含肿瘤细胞和肿瘤微环境，相互作用以建立独特的生理学。在该系统内，肿瘤细胞改变了它们的代谢属性，并相应地提高了它们的代谢速度。胶质瘤的微环境也发生了显着变化。近来，肿瘤细胞代谢与肿瘤微环境之间的相互影响是巨大而复杂的。同时，已经提出肿瘤细胞代谢变化通常发生在肿瘤微环境改变的变化之前。无标签成像工具可以同时评估肿瘤的微环境，并且肿瘤代谢将在手术过程中为神经外科医师提供更全面的信息，从而使神经外科医师能够更好地识别周围正常组织中的神经胶质瘤，目前这是一个巨大的挑战。此外，共同成像的肿瘤微环境和肿瘤细胞代谢的评估将帮助神经科学更多地了解肿瘤代谢与肿瘤微环境之间的复杂相互作用，这将有助于全面阐明肿瘤生物学和改善神经胶质瘤治疗。
　　 在这项研究中，MPM结合图像分析被用于分析胶质瘤中的肿瘤微环境和肿瘤代谢。结果表明，组合方法可以无标记地有效评估肿瘤微环境和肿瘤代谢。首先，方法允许定性和定量评估神经胶质瘤中胶原沉积。在正常脑组织的胶原蛋白含量低，但被发现在神经胶质瘤明显增加。定量数据显示，正常脑组织中的胶原蛋白含量仅为0.005±0.004，而在神经胶质瘤中，胶原蛋白含量增加至0.157±0.123，进一步证明了在神经胶质瘤中胶原蛋白大量沉积。胶原蛋白已被证明在神经胶质瘤的进展中发挥重要作用。传统的H＆E染色技术无法准确描述此功能。然而，由于对胶原蛋白发出的SHG信号具有很高的敏感性，组合方法可以定性和定量地评估肿瘤微环境中的胶原蛋白沉积特征。
　　 此外，由于淋巴细胞和肿瘤细胞之间的荧光差异，海外医疗网研究人员的组合方法可以定性和定量地呈现淋巴细胞浸润。淋巴细胞浸润是神经胶质瘤中肿瘤微环境的另一个特征。淋巴细胞对患者的预后具有重要意义。淋巴细胞的存在表明抗肿瘤适应性免疫应答的预期可能影响患者的生存时间。类似于胶原蛋白，正常脑组织中几乎没有淋巴细胞，但是，在神经胶质瘤基质中，尤其是在双核星形细胞瘤中，出现了许多淋巴细胞并聚集。与H＆E染色图像的协议验证了此表征的MPM信号的准确性。虽然，从细胞核的光信号不能被从染色的组织切片识别的，负反差是由于细胞的细胞质的强烈信号相当明显。迄今为止，尚无关于无标记检测淋巴细胞浸润的研究报道。首次对未染色的神经胶质瘤组织中的淋巴细胞浸润进行了成像。此外方法可以自动评估淋巴细胞的浸润。定量数据还显示，神经胶质瘤中的淋巴细胞密度大于正常组织中的淋巴细胞密度，证实了神经胶质瘤微环境中的淋巴细胞浸润特征。
　　 组合方法允许定性和定量呈现肿瘤血管生成。肿瘤血管生成被看成是在神经胶质瘤肿瘤微环境的一个重要特征，这极大地影响神经胶质瘤的进展。通常，采用血管数量来评估肿瘤血管生成。传统的计算血管数目的方法需要对切除的组织进行染色，然后由病理学家进行手动检查，这既费时又费力。相比之下，MPM与定制开发的图像方法相结合，更可靠，更快速地显示血管生成特征并提供定量数据。神经胶质瘤的血管数目比正常脑组织的血管数目明显增加，直接证实了神经胶质瘤微环境中的血管生成特征。而且，方法使以定量方式评估肿瘤细胞代谢活性成为可能。用NADH强度，FAD强度和光学氧化还原比这三个参数来定量评估代谢活性。随着大脑变成肿瘤，发现NADH强度和FAD强度急剧下降。FAD水平降低是代谢活动增加的指标，通常在肿瘤细胞中观察到随着肿瘤进展。在血管生成的增加和辅酶FAD和NADH的束缚态被假定为这种下降作出了贡献。可用于定量反映病理变化程度的氧化还原比在神经胶质瘤中有所增加。光学氧化还原比的增加表明神经胶质瘤中较高的细胞代谢活性。这些研究结果都与在以往的文献一致的。
　　 综上所述，MPM和图像分析相结合可以无干扰地定量评估神经胶质瘤的肿瘤微环境和代谢活性。随着光纤和探头的小型化和优化，预计这项工作有潜力提供补充信息，以增强神经病理学的诊断准确性，并将激发进一步的研究策略，以了解神经胶质瘤的进展，以预测潜在的治疗方法。已证明MPM能够实现无标记的成像分析，并能够对胶质瘤的肿瘤微环境特征和代谢活性进行快速而准确的评估。作为临床环境中最近开发的双光子内窥镜技术，这种结合的方法可以发展成为神经胶质瘤的有效诊断和监测工具。