替莫唑胺对治疗胶质母细胞瘤的作用 |
胶质母细胞瘤是成人中最常见的原发性恶性脑肿瘤之一。GBM的治疗涉及三管齐下的方法,包括最大程度的近乎安全的肿瘤手术切除,放疗和替莫唑胺的化疗。TMZ是一种烷基化剂,可形成甲基化加合物,导致双链DNA断裂,从而导致细胞凋亡。然而,GBM患者的中位生存期仍少于15个月。尽管TMZ是一线化疗药物,但由于存在既有因素引起的“内在”耐药性或在治疗过程中产生的“获得性”耐药性,它显示了总体中位生存期的最小增加。GBM中的许多细胞信号转导途径都与TMZ抗性相关。在这项研究中,旨在通过开发胶质瘤中TMZ调节的转录组,阐明各种信号转导途径中TMZ介导的改变。观察并验证TMZ处理的细胞中B-catenin途径的激活。研究进一步剖析TMZ介导的B-catenin信号激活的机制。
使用人HT-12v4表达BeadChip平台在对照和TMZ处理的细胞之间进行微阵列。进行注释,可视化和综合发现数据库和基因集富集分析的数据库,以了解有关TMZ处理后丰富的过程,术语和信号传导途径的想法。如补充中所述,通过qRT-PCR,蛋白质印迹和共聚焦技术验证了信号传导的激活。为了在TMZ处理后发现神经胶质瘤中信号通路的变化,在DMSO处理的细胞和TMZ处理的细胞之间进行了转录组分析。出国看病网服务机构观察到TMZ处理后3401个基因受到显着差异调节。DAVID进行的基因本体分析显示,干扰素,Notch,Wnt多种信号通路的丰富,以及凋亡和增殖等过程。进一步使用来自MSigDB的“标志性基因集”对这些基因进行了GSEA处理。观察到除了干扰素信号传导,上皮-间质转化和SHH信号传导以外,B-catenin信号传导显着富集。虽然据报道大多数途径都被TMZ激活,但没有报道表明TMZ介导B-catenin信号传导的激活。接下来使用其他Wnt签名基因集对TMZ调控的转录组进行GSEA处理,并观察到它们显着的正富集,从而证实TMZ处理的细胞中B-catenin的激活。
为了证实上述发现,评估TMZ对神经胶质瘤细胞系中FOPflash构建体活性的影响。观察到TMZ处理后TOPflash报告基因活性显着增加,而FOPflash活性无明显变化。此外,TMZ处理以时间和剂量依赖性方式增加了丝氨酸9上GSK-3B的抑制磷酸化,并降低B-catenin的丝氨酸33/37/苏氨酸41上的磷酸化。观察到TMZ处理的细胞中B-catenin的核定位显着增加。LiCl被用作阳性对照,因为它抑制GSK-3B,从而激活经典Wnt信号传导。TMZ处理后典型的Wnt靶标的转录水平也以时间和剂量依赖性方式增加。另外,DKK1的蛋白水平在治疗TMZ。因此得出结论,TMZ治疗后激活了B-catenin信号传导。Wnt配体通过与卷曲蛋白受体和LRP共受体结合而激活Wnt信号传导。为了了解TMZ处理后Wnt信号激活背后的机制,首先对微阵列数据中所有Wnt配体和几个B-catenin靶的转录水平进行定量。虽然B-catenin靶基因被上调,但Wnt配体未显示任何显着增加,表明在TMZ诱导的B-catenin信号传导激活中存在替代途径。
阿霉素治疗后Akt被激活。发现TMZ治疗后,p-Akt的水平以时间和剂量依赖性方式增加。如所报道的,出国看病网服务机构还证明了Akt信号传导导致神经胶质瘤细胞系的化学抗性。为了研究Akt在B-catenin激活中的作用,评估TMZ在LY294002预处理的细胞中激活B-catenin的能力。TMZ介导的p-Akt和p-GSK-3B的增加以及p-B-catenin的减少减少了。LY294002预处理细胞。在LY294002预处理的细胞中,TMZ介导的Wnt靶标的诱导也显着降低,表明PI3K/Akt途径参与了TMZ诱导的B-catenin活化。由于mTOR复合物2使Akt的S473磷酸化,检查mTOR信号的激活。观察到,TMZ处理后,mTOR信号也被激活。为了找出PI3K/Akt的上游激活因子,集中于DNA损伤途径——ATM-Chk2和ATR-Chk1——也激活了Akt。观察到TMZ处理后Chk2急剧活化,研究ATM的作用。发现TMZ即使在ATM/Chk2沉默的细胞中也能够诱导B-catenin途径,这提示TMZ介导的B-catenin途径的激活涉及独立于ATM/Chk2的PI3K/Akt/GSK-3B级联反应。
恶性神经胶质瘤预示着不良的临床预后。为了在GBM中获得更好的结果,重要的是确定并抑制对放射/化学疗法的激活的致癌途径。研究确定多种途径的显着丰富:干扰素-a/a应答,EMT,SHH和Wnt。其中一些途径改变了胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。B-catenin途径用于进一步表征,因为有报道涉及文献信息冲突。虽然已知B-catenin信号传导与维持正常干细胞的干性有关,但新出现的报道表明在神经胶质瘤干细胞样细胞中该途径的失控。据报道TMZ处理通过启动子甲基化和Wnt3a表达下调抑制B-catenin途径。相比之下,数据表明TMZ治疗后B-catenin途径的激活已通过多种方法进一步通过实验验证。激活的B-catenin信号传导的意义如下:已知在某些癌症中B-catenin途径已经被激活。在这里证明TMZ进一步激活B-catenin途径,并且这种TMZ诱导的B-catenin信号传导为化疗诱导的细胞毒性创造了另外的障碍,如多种测定所示。
最终得出结论,研究首次证明TMZ治疗可导致抗凋亡B-catenin途径的活化,而PI3K途径在TMZ诱导的活化中起着至关重要的作用。还表明在TMZ治疗,因为它已经被报道引起耐药可能影响TMZ介导的细胞毒作用。这项工作不仅提供了对GBM表现出的对TMZ治疗的总体耐药性的机械观察,而且还强调了GBM化疗需要替代药物的需求。
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