特殊蛋白通抑制神经胶质瘤的存活 |
胶质瘤是男性和女性中最常见和最具破坏性的脑癌,并且是与癌症相关的死亡的第二大常见原因。尽管治疗策略发展迅速,但恶性神经胶质瘤患者的预后仍然较差。在癌症发展过程中已在多个层面上全面解决了遗传变异问题,但迫切需要考虑如何利用这些发现来制定新的治疗靶标。河马途径在细胞增殖,器官大小控制,组织再生和肿瘤发生中起关键作用。转录共活化剂与PDZ结合基序,是河马途径的关键下游效应。在细胞中,河马信号的激活可以激活,然后磷酸化TAZ。去磷酸化的TAZ可以易位至细胞核并与TEAD,TAZ配合物在细胞核中的关键部件相互作用,用作转录共激活因子来调节一大组的基因表达,这是与细胞凋亡,增殖相关的,并移民。Hippo途径的激活导致TAZ的磷酸化,从而导致TAZ多泛素化并通过F-box蛋白B-TrCP依赖性方式降解。
TAZ与肿瘤的增殖和转移正相关。在神经胶质瘤中,TAZ可通过与许多间充质基因启动子相互作用来促进恶性神经胶质瘤的间充质特征。结局不良的多形胶质母细胞瘤患者始终显示高水平的TAZ表达。TAZ通过减少替莫唑胺引起的细胞凋亡,增强了通常用于治疗神经胶质瘤的替莫唑胺的耐药性。TAZ在神经胶质瘤细胞的侵袭性表型中起着至关重要的作用。生成了一个截短蛋白,该截短蛋白可以表达TAZ的TEAD结合结构域;并确定其在体内外的抗肿瘤活性,以充分解决抑制TAZ-的功能和机制。TAZBD对恶性神经胶质瘤的TEAD复合体组装。
胶质瘤组织是从医院神经外科研究所获得的,其中包括七个低度星形细胞瘤,19个间变性星形细胞瘤和12个胶质母细胞瘤。在所有病例中均通过组织学证实了神经胶质瘤的诊断。免疫组织化学使用如前所述进行。切片分别用二甲苯和乙醇脱蜡和脱水,然后用0.5%H2O2处理以阻断内源性过氧化物酶。为了进行免疫组织化学分析,将切片用TAZ抗体染色并进行评估。强度和程度染色由两名独立的病理学家评分。
将U251和U87细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中于5%CO2下于37℃培养。通过扩增编码TAZTEAD结合域的DNA片段生成TAZBD。慢病毒TAZ和TAZBD包装在HanbioBiotechnology中,并在U251和U87细胞中进一步稳定表达。在放射免疫沉淀测定缓冲液中裂解整个U251和U87细胞,并对蛋白质浓度进行定量。裂解液用蛋白琼脂糖珠预处理1小时,然后与抗FlagM2或抗TAZ抗体孵育过夜。沉淀物通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并准备用于蛋白质印迹。裂解并定量细胞,然后准备进行SDS-PAGE和转移。封闭膜并用识别Flag,TEAD,TAZ或B-actin的一抗进行探测。相应地选择第二抗体,并通过增强的化学发光法进行检测。用Kodak一维图像分析软件对指示条的强度进行定量,并标准化为B-肌动蛋白。
通过流式细胞术或末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记染色测定法确定神经胶质瘤细胞的凋亡。AnnexinV阳性和碘化丙啶用于检测细胞凋亡率。进行伤口愈合测定以确定迁移能力。细胞在60毫米细胞培养板中生长。细胞达到90%汇合后,刮除单层膜,用200uL移液器吸头形成伤口。刮擦后二十四小时,用显微镜对伤口成像。细胞迁移能力由下式确定:0小时无细胞视野-24小时无细胞视野。通过transwell测定法测量细胞侵袭能力。将10细胞接种到上室中,并用200L无FBS的DMEM培养。将五百微升10%FBS培养基添加到低室中。处理后二十四小时,将滤膜上的细胞用10%Giemsa染色,并用显微镜进行计算。用U87和U251细胞进行集落形成测定播种细胞并计数菌落。准备了四到六周龄的无胸腺小鼠。如前所述,收集U251,U251载体或U251-TAZBD细胞并将其注射到裸鼠的左胁。
因为升高的TAZ是人类癌症恶性临床病理字符相关,以评估TAZ的状态和其在肿瘤进展在人脑胶质瘤的作用,首先在10双人脑胶质瘤组织和邻近正常组织的确定TAZ表达。TAZ信使RNA和蛋白质水平分别通过qPCR和Western印迹测定法确定。与正常组织相比,TAZ主要在神经胶质瘤组织中表达。高级别级肿瘤在mRNA和蛋白水平上均显示更高的TAZ表达。在回顾性队列的31个高级别神经胶质瘤组织中,与7个低级别星形细胞瘤相比,也观察到了高水平的TAZ。差异具有统计学意义。TAZ在神经胶质瘤中上调并且TAZ蛋白升高与肿瘤恶性正相关。由于TAZ‐TEAD复合物在肿瘤发生中的关键作用,建议阻断内源性TAZ‐TEAD复合物的形成可能会阻止TAZ依赖性肿瘤的进展。因此,构建了一个可以表达TAZ的TEAD结合结构域的截短物,并确定了其抗肿瘤活性。与亲本或空载体转染的细胞相比,具有TAZBD稳定过表达的U251和U87细胞显示出低菌落形成能力。TAZBD表达也降低了U251和U87细胞的生长速率。此外,进行TUNEL染色和流式细胞术以确定神经胶质瘤细胞的凋亡。TAZBD表达导致在TUNEL阳性细胞图的数目的增加显著,并且还导致细胞凋亡率的增加抗凋亡蛋白。U251和U87细胞中存在TAZ时BCL-2,BCL-XL和survivin的表达均降低。TAZBD在神经胶质瘤细胞中的表达可能通过诱导凋亡而阻断神经胶质瘤细胞的增殖。还通过U251细胞通过皮下神经胶质瘤模型在裸鼠中确定了TAZBD的抗肿瘤活性。小鼠TAZBD表达细胞显示出肿瘤的发展缓慢的速率,以及所述肿瘤显示出减少PCNA与IHC测定阳性率的。因此,TAZBD在体外和体内均抑制神经胶质瘤细胞的生长。
因为TAZ被示出作为通过促进癌细胞的增殖和转移癌基因。海外医疗网研究人员接下来确定了作用在TAZBD在神经胶质瘤细胞调节肿瘤转移。与Transwell分析法测定的对照细胞相比,过表达UAZ和U87的TAZBD细胞显示出降低的侵袭能力。TAZBD过表达细胞的侵袭细胞数量明显减少。为了证实TAZBD调节的细胞迁移能力,进行了伤口愈合试验,以确定TAZBD是否可以影响神经胶质瘤细胞的迁移。TAZBD表达后,U251和U87细胞的迁移明显减少。TAZBD可通过阻断细胞转移来降低神经胶质瘤细胞的侵袭行为。由于上皮-间质转化是肿瘤迁移的关键步骤,存在TAZBD的情况下进一步确定了与EMT相关的基因表达。观察到上皮标记E-钙黏着蛋白的诱导和间充质标记波形蛋白和N-钙黏着蛋白的减少。TAZBD的表达还降低了Twist和Snail的表达,Twist和Snail是启动EMT的两个关键转录因子。因此,TAZBD在神经胶质瘤细胞中的表达可能通过抑制EMT特性来抑制肿瘤转移。
为了确定TAZBD是否通过阻断TAZ-TEAD复合物而对细胞增殖和转移产生影响,确定TAZ与TEAD在U251和U87细胞中具有TAZ或TAZBD表达的相互作用。免疫共沉淀试验表明,当TAG被Flag抗体拉下时,TEAD可以与TAZ进行连续免疫共沉淀。相比之下,在血清免疫球蛋白G组中未观察到TEAD信号,从而证实TAZ通过与胶质瘤细胞中的TEAD相互作用而作为致癌的转录共激活因子。此外,TAZBD还可以在U251和U87细胞中与TEAD相互作用。TAZBD过表达后,TAZBD与TEAD的相互作用显着降低,表明TAZBD表达通过与TAZ竞争阻止了TAZ‐TEAD复合物的形成。这些数据表明TAZBD通过阻断胶质瘤中的TAZ-TEAD复合物来抑制肿瘤的生长和转移。河马途径在各种细胞功能中起着至关重要的作用,并且在包括人在内的哺乳动物中高度保守。激活河马途径可以激活Dbf2相关家族激酶,该激酶可用于磷酸化TAZ,并因此通过泛素化和降解导致TAZ减少。脱磷酸的TAZ易位到核中并与TEAD相互作用形成转录复合物,以调节许多基因表达,这些基因表达参与细胞凋亡,增殖和迁移的调控。TAZ通过促进肿瘤进展而在癌细胞中具有致癌作用。在各种人类癌症中,这有助于TAZ信号的组成性活化,观察TAZ的基因突变。TAZ蛋白的高表达与高转移潜力有关。由于TAZ对肿瘤生存的主导作用,研究人员建议针对TAZ是各种癌症的治疗一个很好的策略。
一种可以表达TAZBD的新构建体。TAZBD的表达降低了胶质瘤细胞在体外和体内的增殖和迁移能力。机理研究证实,TAZBD通过抑制抗凋亡蛋白BCL-2,BCL-XL和survivin的表达诱导细胞凋亡。此外,TAZBD降低了U87和U251细胞的间充质表型,并相应地阻断了细胞转移。通过TAZBD阻断TAZ-TEAD复合物的形成可能提供了一种新的治疗策略。TAZ蛋白水平在人类癌症中要高得多。为了评估TAZ在神经胶质瘤中的临床意义,确定TAZ在人神经胶质瘤和邻近正常组织中的表达。在神经胶质瘤组织中,TAZ的mRNA和蛋白水平均升高,表明大规模的神经胶质瘤表现出Hippo途径依赖性表型。TAZ表达与神经胶质瘤分期呈正相关。TAZ的高表达表明高胶质瘤恶性肿瘤。TAZ可能有助于肿瘤进展,可以被认为是神经胶质瘤的治疗靶标。TAZ可以通过转录调控靶基因表达来刺激细胞增殖并抑制细胞凋亡。在NIH3T3细胞中,TAZ可以诱导细胞增殖并转移至致癌表型。除了Hippo途径外,磷脂酰肌醇3激酶或有丝分裂原激活的蛋白激酶途径也能刺激TAZ,在大多数癌细胞中它们都被高度激活。TAZ与细胞增殖的关系已被深入研究。TAZ的过表达由于细胞增殖增加和凋亡减少而导致大量组织过度生长。通过TUNEL染色TAZBD过表达后,阳性U251细胞的数量明显增加。TAZBD的存在也增加了U251和U87细胞中的凋亡细胞率。TAZBD表达可能通过诱导细胞凋亡来抑制细胞生长。TAZ的激活主要与TEAD相互作用,并激活哺乳动物细胞中抗凋亡蛋白survivin,BCL-2,BCL-XL等靶基因的表达。survivin的减少与胶质母细胞瘤的抑制有关。这里发现TAZBD降低了survivin,BCL-2,BCL-XL的表达,因此表明TAZBD可能通过抑制TAZ依赖性抗凋亡蛋白的表达来诱导凋亡。
EMT是细胞迁移和入侵的关键过程。细胞内连接和细胞极性丢失,并导致增加的细胞运动能力。具有EMT表型的癌细胞总是显示干细胞的特征,并且对化学疗法具有抗性。在神经胶质瘤中,EMT可导致增强的细胞侵袭和转移潜能,并总是使患者的总体生存期变差。TAZ被示出为具有间充质表型的产生在癌细胞相关联。升高的TAZ与TEAD相互作用并促进胶质母细胞瘤形式的细胞增殖,EMT侵袭和细胞转化。Twist和Snail是EMT诱导剂,可以转录调控EMT相关基因的表达,并促进肿瘤进展。因为有证据表明存在TAZ时可以诱导Twist和Snail,所以TAZ可能通过Twist和Snail依赖性方式参与EMT调节。TAZBD抑制在神经胶质瘤细胞二者扭曲和蜗牛表达,并且进一步诱导上皮标记E-钙粘蛋白和压抑间充质标记物波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达,提示TAZBD的神经胶质瘤细胞中的表达可以潜在地抑制肿瘤转移通过抑制EMT属性。研究人员发现TAZ在神经胶质瘤组织中上调,其阳性表达与恶性临床病理特征有关。TAZBD构建体包含TAZ的TEAD结合域,可有效阻断胶质瘤细胞中TAZ-TEAD复合物的形成,并进一步减少胶质瘤细胞的增殖和迁移,提示通过阻断TAZ-TEAD复合物进行恶性胶质瘤的基因治疗值得研究。
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