藤黄酚对胶质母细胞瘤的抗癌作用 |
成胶质细胞瘤,与不良预后相关联的WHOIV级恶性神经胶质瘤,其特征在于增强的细胞构成,增加的有丝分裂活性,血管过度增殖和pseudopallisading坏死。GBM细胞具有高度侵袭性,可渗入周围的脑实质,包括大脑皮层,小脑,脑干和脊髓。GBM当前的治疗选择以治愈效果不佳为特征,暴露于放射治疗和替莫唑胺的患者的中位总生存期从12个月增加到15个月有限。对症治疗包括皮质类固醇用于治疗肿瘤周围水肿,抗癫痫药减少癫痫发作,以及抗血管生成单克隆抗体贝伐单抗,用于减轻脑水肿。然而,除了改善患者的生活质量,它们赋予无生存优势上GBM患者。现代证据表明,从头开始GBM患者的一年生存率为17–30%,而两年生存率则定为令人沮丧的3–5%。在临床结果背景下,缺乏有效的抗-GBM治疗策略,迫切需要紧急发现新的可作用分子靶标或开发新的有效抗-GBM疗法。最近20年的证据表明,癌症干细胞在增强致癌性和转移表型,对治疗的抵抗力,癌症复发以及因此而导致的临床预后不良中的作用恶性肿瘤,包括GBM。
CSCs转录因子是有前途的抗癌治疗靶标。当代文献充满信号转导和转录的活化剂的记录相关联地增强多能性,相关的CSCs样表型,和癌症进展。STAT蛋白是TF家族,可促进许多生物学过程,例如细胞增殖,分化,存活和炎症。STAT蛋白家族的几个成员的异常表达或活性与多种癌症的发生,发展和转移性传播有关,包括头颈部,乳腺癌和脑癌。STAT3的异常表达与GBM的发生和发展有关,并被认为是神经胶质瘤间充质和恶性转化的主要调节剂。慢病毒介导的沉默STAT3在GBM细胞中诱导细胞分化,表明其在恶性肿瘤中保持未分化细胞状态的作用。与STAT3,STAT5A是詹纳斯酪氨酸激酶的关键效应/STAT途径,其磷酸化带正与GBM细胞侵袭和不良预后有关。STAT5信号传导可驱动GBM细胞的促肿瘤表型。因此,鉴于所有这些暗示STAT3和STAT5A在癌症进展中起关键作用的证据,出国看病网研究调查STAT3和STAT5A参与GBM患者的治疗反应和疾病进展的性质和程度。在过去的二十年中,有关microRNA在包括GBM在内的许多人类恶性肿瘤的恶性化和进展中的关键作用的文献不断增加。可以通过阻碍或促进癌症引发能力中,miRNA已成为抗癌治疗治疗相关的生物分子可操作。一个这样的miRNA家族是miRNA-181,其同种型的不同表达被吹捧为不同癌症类型患者临床预后的独立预测因子。
抗药性GBM的显着特征是O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶,一种从O去除烷基的DNA修复蛋白。在烷基的6位上,从而削弱化学治疗剂的疗效,相反通过启动子甲基化使毫克MT沉默与GBM患者的OS延长和无病生存期相关。最近的研究表明毫克MT的活性与microRNA-181d/miRNA-181d的表达呈负相关。随着GBM患者miRNA-181d表达的增加,其OS改善与正相关。还有累积的证据表明改变miRNA表达的预后意义,被连接到它们的作用在干性信令,例如,陷波,刺猬,和JAK/STAT3调制,以及GBM细胞获得的干细胞样性状;因此出国看病网研究的理由是探索GBM中STAT信号传导下miRNA-181d的可操作性。由于对大多数化学治疗剂产生的不良反应,植物化学和营养保健品已成为引起癌症治疗的安全替代品或佐剂的兴趣。基于先前研究表明,藤黄酚可通过抑制人非小细胞肺癌中的Wnt/B-catenin/STAT3信号转导轴来抑制CSCs样表型,现在出国看病网研究了藤黄酚对GBM茎的可能作用细胞,以及对传统化学疗法的敏感性和更好的预后。藤黄果是印度藤黄果的主要生物活性成分,具有广泛的抗氧化和抗癌作用,并且在化学结构上与众所周知的姜黄素相似。藤黄酚显着抑制结肠癌细胞的生长,并且重要证据表明,藤黄酚与常规化学治疗药物不同,它优先靶向癌细胞。因此,抑制癌症的生长而不会不利地影响邻近的“正常”非癌细胞。在乳腺癌与Garcinol显示抑制STAT3-NF-kB信号,导致降低的侵入性,在体外和在NOD-SCID小鼠[显著减弱肿瘤生长;因此为这种立场下的藤黄醇可能的抗GBM作用的临床前研究奠定基础。调查并记录藤黄醇对GBM的作用,与当前与主题相关的知识相一致,尤其是在单独使用藤黄醇或与常规药物协同作用的情况下GBM-SCs通过STAT3/5A信号传导和miRNA-181d介导的抗癌治疗方式。
伦理学批准和同意参与:出国看病网研究得到台北医科大学双河医院联合机构审查委员会的批准。原发性和复发性GBM患者的组织样本来自台北医科大学双河医院GBM队列。动物研究方案已由台北医科大学动物保护和使用者委员会批准。将购自圣克鲁斯生物技术公司的Garcinol和Z-VAD-FMK溶解在二甲亚砜中制备20mM的储备液,并保存在-20°C直至使用。对于不同的测定,适当时使用细胞生长培养基进一步稀释原液。二甲基亚砜,用作载体和阴性对照。BDPharmingenPE膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I购自BDBiosciences。除非另有说明,否则所有试剂均购自Gibco。使用加利福尼亚大学圣克鲁斯大学Xena功能访问,下载和分析用于STAT3和STAT5A基因表达谱及相关研究的癌症基因组图谱GDC-TCGA胶质母细胞瘤队列基因组资源管理器平台。数据集由非肿瘤,主要GBM和复发性GBM组成。人的U87毫克和GBM8401GBM细胞系购自。在补充了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的GibcoDMEM中培养细胞系。美国卡尔斯巴德,并在5%湿润的CO2培养箱中于37°C孵育。当细胞达到80-90%融合时,将其传代培养,每48-72小时更换一次培养基。患者来源的CD133+GBM球体是由台北医科大学的合作者AlexanderTHWu博士提供的。首先使用建立的流式细胞术方法对患者来源的GBM细胞进行分类。
对CD133+细胞进行分类后,在掺有NeurobasalTM-A培养基的高级DMEM/F12中进行扩展,补充B-27,FGF和EGF;在这些条件下培养可维持CD133+细胞的数量和干性,如先前所述在体内证明其肿瘤启动能力。将GBM8401和U87毫克细胞一式三份接种在96孔板中,每孔浓度为3.5×103个细胞。在5%CO2湿润的培养箱中于37°C孵育24h后,将细胞用指示浓度的2.5–40uM藤黄醇处理24h。之后,将细胞在冷PBS中洗涤,在10%三氯乙酸中固定1h,用蒸馏水洗涤,然后在0.4SRB在1%的乙酸中于室温放置1小时。用1%的乙酸洗涤未结合的SRB染料三次后,将板风干,将键合的SRB染料在缓慢搅拌下溶解于20mMTris碱中5分钟,然后在酶标仪中于570nm波长读取吸光度。裂解经或不经2.5uM或5uM大蒜素预处理24小时的U87毫克和GBM8401细胞,并使用蛋白质提取试剂盒提取细胞蛋白质裂解物,然后使用Bradford进行定量蛋白质测定试剂盒。然后每个泳道上样20ug蛋白质样品,并在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶中分离蛋白质,将印迹转移到聚偏二氟乙烯膜上,然后在5%脱脂牛奶中封闭非特异性结合用Tween20在Tris缓冲盐水中溶解1小时。之后,将带有印迹的PVDF膜与以下一级抗体在4°C孵育过夜。将膜在TBST中清洗三次,每次5分钟,然后与合适的山羊抗小鼠或抗兔辣根过氧化物酶连接的二抗孵育1小时,然后TBST清洗3次,每次5分钟。使用增强的化学发光检测系统,对蛋白条带进行可视化,并使用ImageJ软件进行定量。
该研究得到台北医科大学双河医院联合机构审查委员会的批准。原发性和复发性GBM患者的组织样本来自台北医科大学双河医院GBM研究组。用二甲苯对石蜡包埋的4um组织切片进行脱蜡两次后5分钟,然后分别用100%乙醇两次水化5分钟,95%乙醇5分钟和80%乙醇5分钟再水化,3%过氧化氢用于阻断内源性过氧化物酶活性10分钟。然后将切片在高压锅中浸入10mmol/L乙二胺四乙酸中3分钟,然后用10%正常血清封闭。此后,将组织样品与抗STAT3或STAT5的一抗在4°C下孵育过夜,然后与生物素标记的二抗在室温下孵育1h。将切片在二氨基联苯胺中孵育,然后用苏木精复染。在光学显微镜下进行可视化。为了确定染色,使用Quick评分公式:Q=[染色/阳性细胞百分比]×[染色强度]染色/阳性细胞百分比/分布的最高得分为100,将经过或不经过2.5uM或5uM大蒜素预处理的U87毫克和GBM8401细胞系接种到6孔室玻片中,于4°C孵育过夜,用2%多聚甲醛固定在室温下放置10分钟,并在含0.1%TritonX-100和0.2%牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲盐水中渗透。将载玻片风干并用PBS复水,然后与抗OCT4或SOX2的一抗在PBS中以1:500的稀释度在室温下孵育2小时。用PBS洗涤玻片两次,每次10分钟,然后与抗兔IgG异硫氰酸荧光素偶联的二抗在PBS中1小时。将载玻片用Vectashield固定介质固定,并用4',6'-二mid基-2-苯基吲哚进行反染色,以观察细胞核。
对于肿瘤球形成,和U87毫克细胞GBM8401在Chemicon公司中培养补充有10ng/mL的人重组碱性成纤维细胞生长因子对人胚胎干细胞培养物的无血清培养基HEScGRO,20ng/mL人上皮生长因子,B27补充剂,肝素的STEMCELLTechnologiesInc.和台湾台北的NeuroCultNS-A增殖补充剂。以1×103的浓度接种细胞6孔超低粘附板中的细胞数/mL/孔,含或不含5uM的藤黄酚,并在5%湿润的CO2气氛中于37°C孵育7-10天。在倒置相差显微镜下以40倍的放大倍数对不依赖于锚固的肿瘤球进行计数并拍照。使用NIHImageJ软件从5个随机选择的数字图像场中确定肿瘤球大小。使用以下公式计算了出国看病网的肿瘤球形成效率:MFE=[No.每孔的肿瘤球数]/×100。将U87毫克和GBM8401细胞一式三份以每孔2×104个细胞的密度接种在6孔培养板中,该培养基含有0uM,2.5uM或5uM的藤黄醇。并在37°C下孵育12-14天。将直径≥100um且细胞≥50的菌落的培养板用PBS洗涤两次,用甲醇固定15分钟,并在室温下用0.005%结晶紫染色15分钟。然后在显微镜下观察形成的菌落,并使用ChemiDoc-XRS成像仪进行计数每孔将3×104个U87毫克和GBM8401细胞接种到8um孔膜上,该孔膜在装有无血清DMEM培养基和0、2.5或5uM姜黄素的24孔Transwell腔室的上部腔室中涂有Matrigel,而下部小室包含生长培养基,其中10%FBS用作化学吸引剂。温育24小时后,弃去培养基,并用无菌棉签去除插入物上表面上未侵袭的细胞,同时用3.7%甲醛将滤膜下表面上侵袭的GBM细胞固定1小时。并用结晶紫染料染色20分钟。将染色的细胞在显微镜下可视化,然后使用NIHImageJ软件进行分析。
将U87毫克和GBM8401细胞接种到含10%FBS的DMEM的24孔板中,并孵育直至100%融合后,使用无菌方法沿贴壁单层细胞的中轴划伤200uL微量移液器吸头。用PBS仔细清洗孔,以去除分离的细胞,然后在含有0、2.5或5uM藤黄酚的新生长培养基中孵育24h或48h。在指定的时间点并在显微镜下用10倍物镜拍摄刮伤愈合的照片,并使用NIHImageJ软件进行分析。使用以下公式计算迁移百分比:M=[时间'x'的裸露面积]/×100。按照制造商的说明,使用Trizol试剂从用或不用5uM藤黄酚处理过的U87毫克或GBM8401细胞中提取的总RNA。将2ugRNA添加到实时PCR中,最终引物浓度为0.5uM。PCR在以下条件下进行:在42℃下逆转录60分钟,在94℃下30s扩增30个循环,在58℃下50s扩增和在72℃下50s扩增。按照制造商的说明,使用BDFACSCantoII流式细胞仪系统将PE-AnnexinV/7-AAD染色用于检测细胞死亡。在用PBS洗涤5×105野生型,Z-VAD-FMK处理或藤黄素处理的U87毫克细胞两次,并用膜联蛋白V结合缓冲液洗涤一次后,将细胞与PE标记的膜联蛋白V和7-AAD一起孵育在室温下放置15分钟,然后使用流式细胞仪进行分析。根据制造商的说明,使用阳离子染料JC-1评估线粒体跨膜电位;1×106将U87毫克细胞与10ug/mLJC-1在37°C的黑暗环境中孵育15分钟,然后使用流式细胞仪进行分析。所有样品一式三份进行三次测定。
U87毫克电池接种到24孔板中。将3uLHiperfect转染试剂添加到100uL含miR-181d模拟物或阴性对照的无FBS的DMEM中至终浓度为50nmol/L之后,使用添加10的培养基将孔中的培养基体积调整为600uL。为了评估转染效率,在荧光显微镜下监测绿色荧光蛋白的表达。还通过实时PCR测量了转染的U87毫克细胞中miR181d的表达。该动物研究方案已由台北医科大学动物保护和使用者委员会批准与美国国家卫生研究院关于护理和使用的健康指南一致实验动物。将从BioLASCO购买的NOD/SCID小鼠皮下接种1×106U87毫克细胞,然后随机置于未经处理的对照组或1只毫克/kg接受大蒜素治疗注射,每周5次。使用标准卡尺测量肿瘤生长,并使用下式计算肿瘤体积:v=l×w2×0.5,其中l是最长的直径,w是最短的直径。使用GraphPadPrism5软件使用Kaplan–Meier生存曲线追踪并表示两组的生存率。实验后,人道地处死小鼠,并收集肿瘤样品用于进一步的比较免疫组织化学和miRNA分析。所有实验一式三份进行至少3次。给出的数据代表所有结果的平均值±SD。两组之间的比较使用2面学生t检验进行,而单向方差分析用于比较≥3组。甲p值<0.05被认为是统计学显著。
首先,针对STAT3和STAT5在GBM细胞系中高表达的背景,评估173个样品的STAT蛋白GDCTCGA-GBM队列的表达谱。结果表明一个2.226倍或2.681倍增加的基因表达的STAT3在分别将主要和复发性GBM样本与非肿瘤样本进行比较;同样与非肿瘤对照组相比,STAT5A的中位表达提高1.492倍或2.453倍。如上所述,使用Kaplan-Meier图和基于中位数的基因表达的高/低二分法,生存分析表明,较差的OS与高STAT3或STAT5之间存在显着的关联。STAT3或STAT5高的患者与诊断后第二年低的患者相比,其表达水平分别由15.8%或11.3%的生存优势证明。还证明与STAT3低STAT5A低,STAT3低STAT5A高或STAT3高STAT5A低GBM的患者相比,OS分别为20%,11%或10%,没有STAT3高STAT5A高GBM的患者在诊断后的第三年仍存活,这表明STAT3高STAT5A高与GBM特异性死亡率之间有很强的关联性。此外,与RNA表达一致,免疫组织化学染色结果证实与非肿瘤组织相比,原发性和复发性GBM组织中STAT3,pSTAT3,STAT5A和pSTAT5A蛋白表达水平升高。这些结果至少部分表明,STAT3和STAT5A的增强表达或激活在GBM的发生和复发中起关键作用。
在最近的研究证明藤黄酚通过抑制Wnt/B-catenin/STAT3信号轴抑制人非小细胞肺癌的CSCs表型的背景下,研究可能的STAT信号介导的抗GBM效应大蒜素。首先,提供机制上的见识,证明用2.5uM或5uM大蒜素处理U87毫克或GBM8401细胞可显着下调p-STAT3,p-STAT5,p-ERK和p-AKT的表达,与观察到的STAT3,STAT5和AKT抑制作用同步信号中,藤黄酚显着抑制GBM4801和U87毫克细胞的活力,其中10uM分别引起U87毫克或GBM8401细胞的活力降低51%或25%,40uM引起U87毫克和GBM8401细胞的活力降低94.7%,表明剂量为-依赖的GBM细胞杀伤作用,这种降低的活力与Bax/Bcl-xL凋亡率显着提高有关,因为2.5uM诱导1.67倍或2.7倍U87毫克或GBM8401细胞的凋亡率增加,而5uM分别使U87毫克或GBM8401细胞的凋亡率增加2.83倍或2.92倍。此外,使用藻红蛋白偶联的膜联蛋白V/7-氨基放线菌素染色,出国看病网证明与未经处理的对照组相比,细胞死亡或20uM泛半胱天冬酶抑制剂苄氧基羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮处理的阴性对照,用2.5uMgarcinol处理可增强细胞死亡,而存在20uMZ-VAD-FMK的2.5uM或5uM藤黄酚分别引起GBM8401细胞的5.46%或10.96%凋亡,而其凋亡分别为7.97%或14.11%。U87毫克细胞,表明藤黄酚诱导的细胞死亡是凋亡的和胱天蛋白酶依赖性的。由于高侵入性GBM迅速扩散到周围的脑组织,因此其杀伤力得到证明,试图解藤黄酚是否以及如何影响这种侵入性特征。证明用2.5uM或5uM的剂量依赖性地抑制U87毫克和GBM8401的迁移,分别在24小时时间点的p<0.001)细胞。同样,2.5uM或5uM的藤黄酚可引起60%或80%,并且所入侵的GBM8401细胞数量减少39%或60%。此外,在平行测定中确认藤黄酚的抗癌作用,证明用2.5uM或5uM藤黄酚处理可显着抑制N-钙黏着蛋白,波形蛋白和段塞蛋白的表达,反之则上调表达钙粘蛋白蛋白的表达,因此表明藤黄酚减弱了GBM细胞的上皮-间质转化和转移表型。总之数据表明,藤黄酚通过诱导STAT3/5A以及与增强的细胞凋亡相关的信号传导,显着抑制GBM细胞的活力和致癌性。
非常普遍的和恶性GBM港口自我更新的,致瘤性GBM-SCS促进肿瘤起始和耐治疗。为了评估藤黄酚对GBM-SC的影响,对GBM8401和U87毫克细胞系进行肿瘤球和集落形成分析。肿瘤球试验的结果表明,5uM的藤黄酚会导致两种细胞系从数量和质量上丧失其形成GBM肿瘤球的能力,形成的U87毫克或GBM8401肿瘤球的数量减少约88%,并且U87毫克或GBM8401肿瘤球大小分别减少约96%或89%。此外,由于GBM-SCs起源中克隆性的生物学相关性,证明2.5-5uM的藤黄酚显着抑制GBM细胞形成集落的能力,剂量依赖性,因为2.5uM减少形成数量。U87毫克或GBM8401菌落分别减少49%或36%,而5uM分别导致减少75%或72%。藤黄酚诱导的肿瘤球和集落形成潜能的抑制与干蛋白SOX2和OCT4核表达的显着且剂量依赖性下调相关如免疫荧光法所示,这种抑制作用与p-STAT3和p-STAT5A免疫荧光显着抑制,呈剂量依赖性。
已经确定藤黄酚会破坏STAT3和STAT5A的活化,出国看病网探究藤黄酚与STAT蛋白之间相互作用的可能的调节剂或介体。Hsa-miR-181d与GBM患者的OS较差有关。为此,使用SchrodingerPyMOL2.3分子对接和可视化软件证明或STAT5A相互作用并直接结合,补充先前的预测,即hsa-miR-181d与STAT3的mirSVR或PhastCons得分分别为-0.26或0.69,而它与STAT5A的mirSVR或PhastCons得分分别为-0.21或0.49。同时核苷酸互补性分析结果表明,hsa-miR-181d的5'-UTR以mirSVR或PhastCons得分别为-0.79或0.61结合到JAK2的3'UTR。mirSVR显示基于miRNA/mRNA预测靶位点的序列和结构特征,hsa-miR-181d下调靶mRNASTAT3和STAT5A的可能性。此外,PhastCons评分显示预测的miRNA/mRNA结合核苷酸保守的可能性。对5uM甘菊醇处理过的U87毫克和GBM8401细胞的qRT-PCR分析表明,甘菊醇显着诱导U87毫克中miR-181d的较高表达和GBM8401单元格。此外,在STAT3/5A参与U87毫克或GBM8401细胞的迁移和侵袭性增强后,研究hsa-miR-181d对GBM细胞这些转移表型的可能作用。使用刮擦伤口愈合试验,与未处理的对照或经syn-mir处理的细胞相比,用mir-181d抑制剂处理可显着增强U87毫克细胞迁移的能力,而用mir-181d-mimic进行的治疗会引起迁移的显着衰减,这让人想起5uMgarcinol抑制的迁移。虽然使用mir-181d抑制剂治疗可显着增强U87毫克细胞的侵袭性,但使用mir-181d-mimic的治疗可显着抑制侵袭,这类似于5uM藤黄酚。为了确认STAT蛋白与miR-181d表达之间存在直接关系,进行蛋白质印迹分析,比较暴露于mir-181d抑制剂,mir-181d-mimic或mir-181d抑制剂/大蒜素组合的样品。结果显示,与对照组相比,mir-181d抑制剂可显着增强p-STAT3,p-STAT5,N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达,但抑制E-钙粘蛋白的表达,而mir-181d-mimic-经处理的细胞中,p-STAT3,p-STAT5,N-钙粘着蛋白和波形蛋白的蛋白表达水平显着降低,但E-钙粘着蛋白被上调。对于伴随mir-181d抑制剂和5uMgarcinol孵育的细胞,p-STAT3和p-STAT5的蛋白表达水平明显高于mir-181d-mimic组,但低于mir-181d-抑制剂组。同时观察到与对照组,同型mir处理的细胞甚至mir-181d抑制剂处理的细胞相比,mir-181d-mimic处理明显抑制了JAK2蛋白的表达,类似于同时使用mir-181d抑制剂和5uM藤黄酚治疗所引起的效果,与上述结果一致,并暗示miR-181d介导的JAK2调节的磷酸化STAT3/5A。结果表明,藤黄酚可以激活mir-181d活性,从而抑制JAK2调节的STAT3/5A激活。
已经显示用藤黄酚处理可以在体外抑制U87毫克和GBM8401细胞的癌干细胞样表型,从而确定藤黄酚对体内肿瘤形成和生长的可能抑制作用,生成NOD/SCID小鼠异种移植模型在后胁皮下接种1×106个U87毫克细胞。将小鼠随机分为对照组或大蒜素治疗组。与未治疗的对照组相比,用1毫克/kg的大蒜素进行处理可显着减少在处理过的小鼠中形成的肿瘤的大小,不会对小鼠体重产生不利影响。还观察到在四周的治疗期内,用五丁香酚处理的小鼠显示出100%的存活率,而对照组则为60%。在随后的实验中使用从未经处理和经五丁香酚处理的小鼠中提取的肿瘤衍生的蛋白质裂解物,证明与未处理的对照组相比,STAT3,pSTAT3,STAT5A,p-STAT5A,Ki-67和Bcl-xL蛋白表达伴随水平的抑制,而Bax表达显着增强。此外,对于从接受过1毫克/kg大蒜素处理的U87毫克荷瘤小鼠中提取的肿瘤,与未经治疗的对照组相比,STAT3或STAT5AmRNA表达被抑制了四倍或3.87倍,而miR-181d表达在用1毫克/kg大蒜素处理的U87毫克小鼠中提高了3.52倍。发现表明在体内garcinol通过废除STAT3/5A信号传导和上调hsa-miR-181d来抑制GBM的致瘤性和生长,并同时抑制Ki-67增殖指数和增强Bax/Bcl-xL的细胞凋亡率。
数据的后继研究表明,藤黄酚可在体外抑制U87毫克和GBM8401细胞的癌干细胞样表型,而藤黄酚还可通过上调hsa-miR-181d表达和抑制STAT3/而抑制小鼠GBM模型中肿瘤的形成和生长。5A激活,进一步调查是否确实可以在GBM原代培养细胞中复制这些发现。对藤黄素和Stat3的抗GBM治疗作用的比较分析表明,与原始GBM培养细胞的细胞活力降低25–98%相比,静态降低2.5–40uM,摩尔garcinol处理剂量依赖性地导致原发性GBM培养细胞的活力降低13–96.8%。还观察到在细胞活力降低的同时,2.5和5uM的garcinol或statistic引起p-STAT3的显着下调和在原代GBM培养细胞中的p-STAT5A。此外,用2.5和5uMStatstat处理可使原代培养细胞的迁移减慢49.3%和88.9%,而2.5和5uMgarcinol引起48%和87.5。%。同样证明抑制细胞侵袭的作用,其中2.5和5uM的静态抑制分别导致迁移减少64%和91%,等摩尔garcinol引起51%和84%分别。与静态比较2.5和5uM的藤黄酚可将形成的菌落数量分别减少50.7%和91%。此外,类似于静态,5uM大蒜素使形成的原发性GBM培养肿瘤球的数量减少了91.7%,肿瘤球大小减少了约90%。这些发现不仅验证使用原代GBM培养细胞在体外,体内和离体中都可提供抗丁香酚的抗GBM作用的可复制性,并增强临床或翻译的相关性,而且至少部分证明类似于丁香酚的抗丁香酚对抑制作用通过抑制STAT3/5A的激活来转移原发性GBM培养细胞的转移性和干性表型,表明garcinol通过增强hsa-miR-181d/STAT3抑制转移,癌干性和肿瘤生长或hsa-miR-181d/STAT5A。
STAT3和STAT5是与多种肿瘤细胞增殖,迁移和侵袭有关的转录因子。STAT3和STAT5A分别响应其细胞因子和生长因子,通过其Y705位置和Y695残基的磷酸化而被激活,随后磷酸化蛋白的核易位并随后激活特定的下游基因转录。STAT3和STAT5的激活具有不同的用途。STAT3已显示出可促进GBM肿瘤核心的增殖和病理生物学,而STAT5影响其局部侵袭能力。有证据表明,STAT3信号传导在维持神经胶质瘤干细胞的自我更新能力和多系分化潜能中起作用。与STAT3一样,STAT5A基因的遗传改变与骨髓增生性疾病有关,并与造血干细胞增殖有关。过去研究表明,藤黄酚可抑制STAT3活化并抑制肺癌干细胞群。在出国看病网研究中调查胶质母细胞瘤患者是否还表现出高水平的STAT3和相关的STAT5A,对GDC-TCGA胶质母细胞瘤队列进行RNAseq分析,并证明原发性和复发性胶质母细胞瘤患者均具有较高的STAT3和STAT5表达。与以往的证据表明胶质母细胞瘤细胞系中STAT活性异常有关,免疫组织化学分析显示STAT3/5A扩增原发性和复发性GBM中的表达。RNA和蛋白质表达的增加表明STAT3和STAT5A在驱动GBM肿瘤发生中起关键作用。此外,复发性胶质母细胞瘤显示出STAT5A表达增加的总体趋势,表明STAT5A在维持GBM-SC表型中具有特定作用。通过分析基于STAT3/5A表达的差异生存率后,STAT3和STAT5A均高表达被发现与最差的操作系统时间密切相关;可能与肿瘤诊所GBM的致瘤性和致死性增强有关。在翻译相关性方面,观察到STAT3高位STAT5A低位队列和STAT3低位STAT5A高位队列之间的OS时间没有显着差异,这表明在抑制任一转录因子的表达方面没有特定优势,并强调平行抑制的可能治疗效果双方STAT3和STAT5A。
因此如STAT3高STAT5高与其他研究组相比,首次证明,在蛋白质和mRNA水平上一致靶向靶向GBM中STAT3/5A的异常表达或活性对于任何有意义的治疗都是必不可少的原发性甚至复发性GBM患者基于STAT的靶向治疗的疗效。即联合靶向STAT3和STAT5可有效逆转高度耐药的BCR-ABL1T315I慢性髓样淋巴瘤细胞中各种形式的酪氨酸激酶抑制剂耐药性。在GBMSCs表型包括增强的增殖,致癌性,治疗耐药性,复发和不良预后的背景下,进一步证明藤黄酚以剂量依赖性方式显着抑制GBM8401,U87毫克和GBM原代培养细胞的活力,以及抑制细胞的侵袭和迁移潜能,从而证明糖精在GBM中的抗增殖和抗转移功效。这与已证明的藤黄酚对结肠癌和永生化的肠道细胞具有强大的生长抑制作用相一致。由于STAT3和STAT5A与维持GBM的干细胞样特征有关,研究藤黄酚对GBM-SCs的抑制作用。低剂量的藤黄酚通过抑制的AKT和ERK串扰使STAT3/5A信号失控,这足以显着阻碍GBM细胞迁移,侵袭,克隆形成和肿瘤球形成,并伴随凋亡指数和核表达的增加。发现得到STAT3和STAT5的最新证据的证实在恶性细胞中被组成性激活,它们的持续激活通过表观遗传修饰,EMT诱导,肿瘤微环境的致癌修饰和增强CSCs的自我更新和分化来改变下游基因表达,从而促进癌症的发展和进展。以及在表达和表达SOX2的神经胶质瘤干细胞的获取和维持中涉及高ERK1/2活性的证据。
这项研究首次证明,在体外,离体和体内,藤黄酚诱导的STAT3和STAT5A的抑制与hsa-miR-181d表达的显着上调有关。还显示hsa-miR-181d与STAT3或STAT5A蛋白之间的直接相互作用。认为用藤黄酚处理后,miR-181d以JAK2介导的方式典型地抑制STAT3/5A的激活/磷酸化,miR-181d非典型地直接结合STAT3或STAT5A的编码区。mRNA,引起STAT3/5A降解,从而削弱STAT3或STAT5A的激活在GBM单元中。证明hsa-miR-181d的肿瘤抑制作用与以下发现一致:miR-181d的过表达通过下调Derlin-1,抑制癌细胞的体外增殖,迁移和细胞周期进程来显着抑制食管鳞状细胞癌,以及在体内以及在神经胶质瘤样品和细胞系中抑制致瘤性,异位表达miR-181d通过靶向K-ras和Bcl-2抑制增殖并诱导细胞周期阻滞和凋亡。考虑到JAK–STAT信号通路的作用已被充分证明,尤其是其分子效应子,即证明藤黄素调节的miR-181d/STAT3/5A信号轴具有治疗意义。STAT3和STAT5充当癌细胞和致癌过程中几种信号通路的汇合点。虽然不能完全解释甘菊醇诱导的hsa-miR-181d如何抑制STAT3和STAT5的激活,但出国看病网的数据发现,越来越有证据证明miR在JAK-STAT的中的作用。是miR-204,其对总非常不明显的作用同样有STAT3的表达,但受损的STAT3磷酸化,从而诱导癌细胞凋亡和抑制细胞增殖,迁移的体外和体内肿瘤生长。此外最近的报道表明,经卡波西氏肉瘤相关的疱疹病毒miRNA损害STAT3/5的激活/磷酸化,并抑制IL6处理后STAT3依赖性报告基因的激活,这也为hsa-miR发现提供了依据-181d可以直接与结合STAT3/5A,损害的后激活。
综上所述,出国看病网研究提供证据表明GBM中STAT3/5A的组成性激活与抑制的hsa-miR-181d表达呈负相关,并且JAK2介导的菊糖诱导的上调。hsa-miR-181d/STAT3和hsa-miR-181d/5A的比值是STAT3/5A上瘾的GBM中糖醇的抗GBM-SCs效应的基础。这些发现具有意义,因为它们突出一种相对新颖的STAT3/5A小分子抑制剂的治疗功效在高侵入性且经常具有治疗抵抗力的GBM中使用。此外,本试验研究中记录的发现为进一步大规模队列研究基于甘菊醇调节的hsa-miR-181d/STAT比值作为GBM中的治疗策略的临床前可行性和随后的临床适用性奠定了基础。
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