胶质母细胞瘤是原发性恶性脑肿瘤最常见的和积极的形式。尽管多个治疗已经出现在最近几年，如手术，放疗，化疗，患者的总生存期胶质母细胞瘤并没有显著改变。胶质瘤干细胞日益被认为是支持神经胶质瘤发展，对治疗的抵抗力和恶性复发的驱动力。GSC具有自我更新的能力和多能性，并且可以诱导肿瘤发生。阐明控制GSC的分子机制可能为开发针对GBM的靶向治疗提供新的信息。溴基结构域和额外结构域蛋白是调节多种重要的生物学过程，如转录调控，染色质重塑和DNA损伤修复。BET蛋白首次在NUT中线癌中具有致癌作用。通过筛选针对急性髓细胞性白血病中已知染色质调节剂的小发夹RNA的文库，随后的研究确定了含溴结构域的蛋白4是维持AML的重要因素。BET蛋白尤其是Brd4，已成为治疗几种癌症的重要治疗靶点。这些发现表明Brd4可能是治疗GBM的治疗靶标。小分子BET抑制剂JQ1可以竞争性地与BET溴结构域中的乙酰化赖氨酸残基结合，以防止BET蛋白与染色质结合。BET溴基结构域的抑制剂能抑制c-Myc的转录，存在用于临床治疗的Myc驱动癌症的潜在目标，包括GBM。在几种癌症，JQ1具有显着的抗炎和抗肿瘤作用的体外和体内。尽管有一些研究检查了Brd4，但尚未确定其在GBM肿瘤发生中的作用，而且JQ1治疗GBM的潜力尚未得到充分开发。
　　 为了解决这些不确定性，海外医疗网研究人员在体外和体内研究了使用JQ1或小干扰RNA在GSC中Brd4的作用。JQ1处理的GSC的转录组测序分析表明，Brd4与PI3K-AKT途径密切相关。揭示血管内皮生长因子调节GSC的细胞周期进程和细胞凋亡的机制，这部分可以解释Brd4参与JQ1的抗肿瘤作用。Brd4在GBM的发生和发展中的作用，并揭示其潜在的分子机制。确定JQ1是治疗GBM的新型抑制剂。
　　 从人神经胶质纤维酸性蛋白磷酸酶张力蛋白同源物中分离出原代鼠神经胶质瘤干细胞；在本研究中未进行细胞分离。GSC的数目编码与转基因小鼠的编码数目相同。hGFAP-Cre转基因可使用条件性p53和Pten位基因在所有CNS谱系中单独删除p53或与Pten组合删除。出现急性发作的神经系统症状。所有具有恶性神经胶质瘤的42只神经系统症状小鼠被分类为间变性星形细胞瘤世界卫生组织。患者来源的神经胶质瘤干细胞TS543。CSC2078和CSC1589在具有表皮生长因子的神经基础培养基中培养，并具有碱性成纤维细胞生长。因子或分化培养基。在补充表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的NeuroCultNS-A增殖培养基中培养TS543细胞。在37°C的5％CO2中培养。将CSC2078细胞以每孔2×10细胞接种到6孔板中过夜。次日，CSC2078用三个独立的特定BRD4-的siRNA48小时。转染效率通过蛋白质印迹法确定。
　　 为了确定对JQ1的剂量反应，将细胞以10,000个细胞的密度一式三份接种到96孔板中，并粘附过夜。将细胞用JQ1系列稀释液在37°C下处理24或48h。JQ1通过加入2倍系列稀释液。siRNA转染CSC2078细胞24、48和72小时。细胞计数试剂盒8解决方案添加到板的每个孔中。将板在37℃下孵育4小时。使用酶标仪在450nm处测量吸光度。对于软琼脂菌落测定，将6,500孔板中的每个孔一式三份地铺板2,500个细胞。琼脂下层的浓度为0.6％，上层的浓度为0.4％。将琼脂与神经基础培养基或NeuroCultNS-A增殖培养基按1：1比例混合。在接种GSC10-15天后，在室温下用0.1％结晶紫染色1h后，对五个随机显微镜视野中的菌落数进行了计数。使用光学显微镜在五个随机显微视野中以×400的放大倍数捕获图像。通过神经球形成测定法测量自我更新能力。将细胞培养于6孔平板以一式三份，并用JQ124小时，并在37℃下的siRNA48小时转染细胞。将神经球在含有生长因子的NSC增殖培养基中于37°C培养10天。10天后，对包含>50个细胞的神经球进行评分。在IX71光学显微镜下以×100和200的放大倍数计数每个孔中的神经球的数量。数据表示为球形细胞相对于对照的百分比。细胞在6孔板中接种，并用JQ1和利尼24小时。用siRNA转染CSC2078细胞48小时。研究人员在4°C下用1ml70％乙醇固定细胞过夜。根据制造商的规程，使用碘化丙锭染色溶液检测收集的细胞。使用流式细胞仪和ModFitLT5.0分析细胞周期。
　　 用膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯和PI对经媒介物，JQ1/linifanib和JQ1+Linifanib处理的细胞进行染色。用二甲基亚砜处理经媒介物处理的细胞。用早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的总和计算凋亡率。使用DeadEnd荧光TUNEL系统检测CSC2078-皮下异种移植小鼠肿瘤的凋亡。使用OlympusBX53显微镜以×400放大倍数捕获细胞和肿瘤组织的图像。为了定量，使用ImageJ1.46r在每个样品的五个随机区域图像中对TUNEL阳性细胞进行计数。CSC1589细胞用JQ1处理24小时。将CSC1589用4％的聚甲醛进行固定5分钟。然后，将CSC1589用1mg/ml的Hoechst在室温下于黑暗中染色10分钟。最后，将细胞用PBS洗涤3次，并用OlympusBX53显微镜以×400放大率成像。将GSC在苯甲基磺酰氟和放射免疫沉淀分析裂解液中裂解，并在4°C超声处理收集的裂解液，然后在4°C以12,000×g离心15分钟上清液用作细胞裂解物。
　　 将每个基因的读取计数值与原始值进行比较基因表达，然后使用每千个转录本的千分之一片段标准化表达。然后，研究人员使用DESeq在筛选条件下分析差异表达的基因，对样品的所有不同基因进行双向聚类分析。研究人员将所有基因映射到GO数据库中的术语，并计算每个术语中差异富集基因的数量。基于整个基因组，通过超几何分布计算出显着富集差异富集基因的项。根据KEGG途径富集分析，研究人员计算了差异表达基因的数量；确定了差异表达基因主要参与的代谢途径和信号传导途径。
　　 总共使用10只小鼠，每只体重18-22g。将小鼠在22±2℃的空调房间内以12小时的光暗周期饲养，自由进食和饮水。在异种移植实验中，在裸鼠的右胁侧皮下注射CSC2078细胞，悬浮于100ulPBS。2天后，将JQ1处理组的裸鼠腹膜内给予JQ1，持续17天。用生理盐水稀释含DMSO的JQ1，在JQ1处理组中获得5mg/ml的最终溶液。对照组的小鼠每天注射等量的含5％DMSO的生理盐水。研究人员每天用卡尺测量体重和量肿瘤大小。通过鼠标活动评估或小鼠体重减轻来判断人道终点。没有动物被处死；17天后通过二氧化碳处死所有小鼠。在二氧化碳安乐死之前，通过腹膜内注射剂量为300mg/kg体重的10％水合氯醛麻醉10只小鼠。每分钟以10-30％的体积施加100％的二氧化碳，并在暴露于二氧化碳5-6分钟后对小鼠实施安乐死。当在2-3分钟内没有自发呼吸并且没有观察到眨眼反射时，确认了小鼠死亡。没有应用第二种方法来验证小鼠的死亡。对小鼠实施安乐死后，将提取的肿瘤组织分为两部分：一部分在-80°C下冷冻以进行蛋白质和RNA提取，另一部分在4％多聚甲醛中固定以进行免疫荧光分析。染色。切除内脏组织进行苏木精和曙红染色。对照组中最大的肿瘤直径为13毫米，JQ1治疗组的直径为7毫米。
　　 处死经媒介物和JQ1处理的CSC2078异种移植模型组的动物，并在PBS中冲洗肿瘤，然后在室温下用4％多聚甲醛固定24小时。将肿瘤切成五微米米厚的部分，并安装在聚D-赖氨酸涂层的幻灯片上。两组数据的比较使用未配对的学生t检验。为了比较两套以上，进行了单向方差分析和Newman-Keuls事后检验。用至少三个独立的实验进行所有定量。数据表示为平均值±平均值的标准误。P<0.05被认为指示统计学上的显着差异。为了评估表观遗传基因在GSC中的作用，使用siRNA沉默Brd4的表达，以检测Brd4对GSC活性，增殖和自我更新能力的影响。进行蛋白质印迹以检测用Brd4特异性siRNA转染的CSC2078中Brd4的蛋白表达。这证明了靶向Brd4的siRNA的有效性。探讨了沉默Brd4对GSC增殖和自我更新的影响。使用CCK-8分析法检测了用siBrd4s转染的CSC2078的细胞活力。Brd4沉默显着降低了细胞活力。细胞生长曲线和琼脂软菌落形成试验表明，与对照相比，三种独立的Brd4siRNA对CSC2078细胞具有显着的抗增殖作用。进行了神经球形成实验，以检测最有效的siRNA对CSC2078细胞自我更新能力的影响。靶向Brd4的siRNA有效抑制了CSC2078细胞的自我更新能力。综上所述，结果表明Brd4在介导对GSC的抗肿瘤作用中具有重要功能，并且Brd4可能是消融GSC的潜在治疗靶标。
　　 为了探索JQ1对致瘤特性的影响，评估TS543，CSC2078和CSC1589中的细胞增殖和自我更新。CCK-8分析显示，与JQ1处理24和48小时后，与对照组相比，细胞活力以浓度依赖性方式显着降低。接下来，用JQ1处理CSC2078，TS543和CSC15893天后，使用细胞生长曲线分析了细胞增殖。JQ1显着抑制了所有三个GSC系的增殖。JQ1显着降低了GSC的克隆形成能力。用JQ1处理10天后，细胞克隆的数量明显减少。这进一步支持了JQ1有效抑制GSC的增殖。另外，神经球形成测定显示，通过用各种浓度的JQ1处理10天，神经球数量显着减少。用JQ1处理GSC具有与Brd4沉默相似的效果。JQ1的抗肿瘤作用可有效抑制GSC的增殖和自我更新。探索JQ1和siBrd4抑制细胞增殖的机制，评估了它们对GSC的细胞周期和凋亡的影响。通过流式细胞术分析了用JQ1处理24h的CSC2078和TS543细胞以及用siBrd4转染48h的CSC2078的细胞周期。JQ1显着增加了G1细胞的百分比，减少了S期的细胞百分比。观察到对G2期细胞百分比的显着影响。用siBrd4转染的CSC2078中观察到了类似的G1细胞周期阻滞作用。总的来说，这些数据表明JQ1阻碍了细胞周期进程。用JQ1和siBrd4s处理也诱导了GSC中的细胞凋亡。使用I染色通过流式细胞仪评估了CSC2078和TS543细胞的凋亡。在用JQ1处理的两种细胞系中，凋亡细胞的数量均显着增加。使用siRNA沉默Brd4可以显着诱导CSC2078细胞凋亡。Hoechst33342染色表明，JQ1处理后凋亡的CSC1589细胞数量显着增加。TUNEL染色的结果还证实了JQ1促进CSC2078细胞凋亡的能力。这些数据表明，JQ1通过诱导细胞周期停滞和凋亡而降低了生存能力并抑制了GSC的增殖。
　　 用JQ1处理CSC2078会引起生物活性的多种变化，其中“细胞分化”尤为突出。差异表达基因的RNA-seq分析表明，在JQ1处理组中神经干细胞标记Nestin和睫状神经营养因子显着下调。通过CSC1589细胞的免疫荧光染色检测了Nestin的表达。结果表明，在JQ1处理的细胞中Nestin的蛋白质表达水平显着下调。通过RT-qPCR检测了CSC2078中巢蛋白的mRNA表达。用JQ1处理24小时后，巢蛋白的mRNA表达水平显着下调。另外，星形胶质细胞标记物S-100β被上调，而少突胶质细胞标记物血小板衍生的生长因子α被强烈下调。在JQ1处理的细胞中，神经元前体标记物III类b-微管蛋白明显上调。JQ1可以在增殖条件下抑制NSC标志物的表达并促进GSC向星形胶质细胞的分化。通过该调节BRD4的GSC中生长的机制，进行与JQ1处理24小时CSC2078细胞的RNA-SEQ比较。分别有1,327和1,484个基因被上调和下调。KEGG是包含基因组，生物途径，疾病的数据库的集合。与整个基因组背景相比，这些数据库可以识别候选靶基因之间的显着富集途径。富集散点图中显示了候选目标基因富集的前20个途径，并使用富集因子，q值和基因数来报告KEGG富集程度。
　　 PI3K信号传导被包括VEGF在内的多种生长因子激活。用JQ1处理的CSC2078细胞中下调的生长因子。发现VEGF被最大程度地抑制。VEGF由癌细胞释放以诱导肿瘤血管生成，并可以通过MMP9从细胞外基质分泌，从而促进肿瘤生长。使用蛋白质印迹法检测了JQ1处理的CSC2078细胞中VEGF和MMP的表达。因此，研究人员初步推测JQ1通过信号通路表现出抗肿瘤作用。提出JQ1可以下调VEGF下游的MMP2和MMP9蛋白，从而控制GBM的血管生成和转移并抑制肿瘤的发展。进一步验证JQ1通过信号通路在GSC中起抗肿瘤作用，研究人员选择了VEGR2抑制剂利尼法尼进行进一步的实验。Linifanib是一种新型的酪氨酸激酶抑制剂，其选择性靶向VEGFR和PDGFR，并且具有低脱靶抑制活性。通过流式细胞术分析了用JQ1和利尼法尼治疗24小时的CSC2078的细胞周期。研究人员发现JQ1，单独或联合利尼法尼诱导CSC2078的细胞周期停滞。此外，用JQ1和Linifanib治疗可显着诱导CSC2078细胞凋亡。与linifanib治疗组或联合治疗组相比，JQ1治疗组的细胞凋亡率无显着差异。利尼法尼或联合治疗24小时的CSC2078中，磷酸-VEGFR2，PI3K，磷酸-AKT，细胞周期蛋白B1和Bcl-2的水平降低。Bax的表达增加并且VEGFR2和AKT没有显着改变。与单独使用每种药物进行治疗相比，与JQ1和linifanib共同治疗不会引起活性的更大减弱，并且不会进一步诱导细胞周期停滞。这些结果进一步表明，JQ1通信号通路对GSC发挥抗肿瘤作用。
　　 在KEGG途径富集分析中，细胞周期显着富集。为Brd4调节GSC中细胞周期进程的机制，使用RT-qPCR检测了用JQ1处理的CSC2078和TS543细胞中与细胞周期相关的基因。然后，通过Western印迹检测了用JQ1或siBrd4处理CSC2078后细胞周期蛋白的蛋白水平，发现c-Myc和CyclinD1的蛋白表达被显着抑制，而P27被显着上调。JQ1或siBrd4降低了Rb蛋白的表达，但p-Rb蛋白的表达水平没有明显变化。Rb蛋白未被激活。E2F1无法从复合物中释放出来以促进下游基因的转录。复合物失活，导致在用JQ1或siRNA处理的GSC中出现周期停滞。
　　 由于AKT可以激活许多类型的癌症中的细胞凋亡，因此研究人员研究了Brd4对GSC中凋亡基因的影响。使用RT-qPCR来验证JQ1和siBrd4对信号传导中重要的凋亡基因的影响。通过免疫印迹研究了JQ1或siBrd4对GSC中凋亡蛋白的影响。裂解的胱天蛋白酶3和Bax的蛋白表达明显上调，而Bcl-2被抑制。发现yH2AX的蛋白表达明显上调。JQ1或siBrd4引起DNA损伤，如比值所示，这进一步促进了GSC的凋亡。从研究人员的结果来看，JQ1和siBrd4s处理的细胞之间的趋势是一致的。siBrd4或JQ1可以通过GSC中的信号轴表现出促凋亡作用。
　　 评估JQ1对胶质母细胞瘤肿瘤异种移植模型的治疗效果。每天一次通过腹膜内注射用50mg/kg的JQ1处理具有CSC2078皮下肿瘤的裸鼠，并在第17天处死。结果表明，JQ1治疗组的肿瘤体积明显小于对照组。使用TUNEL染色检测从对照组和JQ1处理的小鼠获得的肿瘤组织中的细胞凋亡。在JQ1处理的肿瘤中，凋亡细胞的数量显着增加。H＆E染色的结果表明，JQ1治疗组的肿瘤组织显示出明显的核收缩。为了检测JQ1对小鼠的毒性，在小鼠的器官中进行了H＆E染色。在经JQ1处理的小鼠中没有明显的组织病理学发现。与对照肿瘤中的发现相比，在JQ1处理的肿瘤中Brd4和AKT的蛋白表达水平没有明显变化，而PI3K和磷光性AKT被下调。BAX和yH2AX表达显着增加。总之，这些数据表明JQ1可以有效抑制肿瘤发生和GBM的发展。JQ1的治疗作用可能值得临床试验。
　　 BRD4是很有价值的，作为GBM。因此，针对Brd4的疗法可能有助于开发更有效的治疗选择，以改善生活质量并延长GBM患者的生存期。表观遗传异常在神经胶质瘤中普遍存在。后生分析可能是开发更有效的治疗策略用于GBM。表观遗传阅读器Brd4已成为许多癌症的治疗靶标。BRD4是NUT中线癌和造血疾病的重要的治疗靶标，和令人鼓舞的结果已经获得。研究BRD4作为药物靶标肝癌，乳腺癌和胰腺癌已经成为过去的十年中。很少有研究探索Brd4作为神经胶质瘤细胞的药物靶标的作用。GBM是高度异质性肿瘤；这种异质性由GSC的存在决定。最重要的是，研究的GSC的原因是，它们已显示是高度致瘤性在体内，并表现出对常规化疗和放射治疗显着性。GSC存在于整个肿瘤中，并可以沿着白质途径迁移，通常甚至可以避免总切除，这为GBM复发提供了可能性。在特定的微环境生态位中保持了高度抗药性和致瘤性亚群。GBM是实体瘤中血管化程度最高的肿瘤之一。微血管增生已被认为是GBM发生和发展的重要特征。GSC高度促进angiogen-ESIS和VEGF的表达，吸引内皮细胞的肿瘤和驱动新血管生长。因此，使用GSC进行实验可能会增加研究人员的结果的价值。
　　 JQ1和Brd4具有共晶体结构，JQ1对Brd4具有高亲和力和特异性。在实验中，JQ1的抗肿瘤作用与siBrd4的抗肿瘤作用一致。RNA-seq实验的结果表明JQ1选择了几个紧密相关的靶标，并且仅影响了几个基因。JQ1表现出少量脱靶效应，提高了其作为表观遗传疗法的功效。JQ1具有出色的药代动力学特性，包括49％的口服生物利用度和强大的穿越血脑屏障的能力，这为其在治疗GBM中的应用奠定了基础。先前的实验集中在JQ1对肿瘤细胞增殖的抑制作用上，JQ1也具有一定的促进细胞分化的潜力。发现JQ1在增殖条件下可以抑制NSC标志物Nestin和睫状神经营养因子的表达，并促进GSC向星形胶质细胞的分化。JQ1在促进GSC中的作用有待进一步研究。作为药物靶标肿瘤治疗，BRD4是参与许多信号传导途径，包括Wnt信号，刺猬，和PI3K-AKT途径。选择途径进行进一步研究的原因有两个。首先，信号通路在信号转导的调控中起着重要作用。该信号传导途径介导的各种生物过程，例如细胞增殖，细胞凋亡，代谢和血管生成的GBM。已经认识到该信号传导途径经常被包括GBM在内的恶性脑肿瘤的遗传和表观遗传学改变所激活。信号通路的过度激活与GBM细胞的快速生长，肿瘤进展和多药耐药性密切相关。其次，除了信号通路外，还有Rap1，P53和FoxO信号通路。这些信号传导途径的富集因子和错误发现率值并不明显优于信号传导途径。但是，信号通路在这些信号通路中具有最重要的DEG数。总之，研究中选择了信号通路进行进一步分析。AKT主要具有两个重要的磷酸化位点，Thr308和Ser473。丝氨酸473的磷酸化是必要的AKT的完全活化。T308的磷酸化仅能部分激活AKT，但尚不清楚在S473的磷酸化之前是否有必要。其次，人类癌症中AKT活化的升高可能是由于Ser473位点上AKT的活化磷酸化增强所致。因此，研究人员选择磷酸化AKT作为PI3K底物进行研究。AKT是VEGF的重要介质。信号传导介导VEGF诱导的内皮细胞血管生成刺激。作为信号传导途径的重要组成部分，AKT亚型在几个细胞过程，包括抗细胞凋亡，增殖，生长，DNA修复，运输，代谢，血管生成中发挥重要作用，和干细胞的自我更新。在GSC中起重要作用的新型信号转导轴。JQ1抑制VEGF和磷酸化VEGFR2的表达，从而降低了VEGF下游PI3K的表达，并抑制了磷酸化AKT的活性。尽管机理尚不清楚，但JQ1显着降低了MMP蛋白的表达，从而阻止了ECM分泌VEGF，从而促进了血管生成和肿瘤生长。用JQ1或siBrd4处理导致AKT下游的凋亡和细胞周期相关基因发生相应变化。Rb蛋白结合并调节E2F家族的成员。E2F1是E2F家族成员正调节从G1期向S期过渡的转录活化因子。活性细胞周期蛋白复合物使蛋白磷酸化，而磷酸化的Rb无法与E2F相互作用。E2F被激活使其能够促进进入S期所需的基因转录。由于抑制了Ser473的AKT磷酸化，下游目标基因cyclinD1的表达减少，而CDKIs的表达增加。Rb蛋白没有被磷酸化，E2F1无法从复合物中释放出来，以促进包括c-Myc在内的下游基因的转录，从而导致细胞周期停滞。在Brd4沉默后，AKT下游的凋亡相关基因的表达受到影响。siRNA或JQ1处理对Brd4的抑制作用导致DNA损伤增加，从而进一步促进GSC的凋亡。
　　 Brd4在GBM中的作用吸引了研究人员的注意力，但是研究人员的研究存在一些局限性。将来，需要进一步的实验来沉默或过表达该途径中涉及的基因，以确认结果并获得进一步的见解。JQ1也具有促进GSC分化的巨大潜力，使进一步的研究有价值。但这项研究确定了表观遗传蛋白Brd4是治疗GBM的有希望的靶标，并提出了使用JQ1治疗GBM的可行性。总而言之，研究人员的实验确定了基于表观遗传学的针对GBM的靶向治疗方法的前景广阔，这些发现将有助于对该新策略的快速临床评估。