胶质母细胞瘤是人类最恶性的脑瘤类型，每年在德国诊断出约3,000起事件病例。即使在最高水平的护理和采用新的治疗策略的情况下，GBM患者的中位生存期仍小于20个月，而在过去的十年中，生存时间仅略有改善。开发新的治疗策略是必要的。GBM的高水平恶性肿瘤是其特征性行为的结果，包括免疫抑制，高水平的抗辐射性，大多数化疗药物和低氧性。另外，该肿瘤表现出广泛的新血管生成，并且侵入性地生长到健康的脑组织中，使得不可能进行完全的手术切除。脑肿瘤起始细胞，也称为神经胶质瘤干细胞样细胞，是GBM细胞的极强抗性亚群，被认为是导致肿瘤起始和复发的原因。用于治疗GBM的标准化疗药物替莫唑胺导致GBM细胞向更多干细胞的表型脱分化。参与这一过程是信号级联有丝分裂原激活的蛋白激酶途径，这是在GBM细胞组成型活化。这些途径的下游底物为Y盒结合蛋白1，显示出两者的转录和翻译活性的蛋白质。在许多肿瘤类型中，YB-1的表达与恶性和进展相关。细胞应激，例如由于辐射或化学疗法诱导的DNA损伤而引起的细胞应激，诱导了几种翻译后YB-1修饰，包括磷酸化，乙酰化或SUMOylation。这些修改建议宣传核易位。随后，核YB-1激活了多药耐药蛋白的表达，这是抗肿瘤治疗的经典介体。
　　 YB-1参与治疗性腺病毒的复制。的YB-1依赖性溶瘤腺病毒XVir-N-31本研究组，也被称为的Ad-Delo3-RGD显影，复制在肿瘤细胞中携带核YB-1。在携带R28细胞源性神经胶质瘤的小鼠中，一次肿瘤内注射XVir-N-31可延长存活率。在约60％的BTIC中，YB-1上调并主要位于细胞核中，这与这些细胞的良好病毒复制和病毒介导的裂解有关。在约40％的BTIC中，YB-1仅少量表达并且主要位于细胞质中，从而将病毒复制减少了100-1,000倍。建立的癌细胞系的照射导致YB-1的易位到细胞核。尚未确定在BTIC中是否也会发生这种情况。本研究评估了与治疗有关的辐射剂量是否在体外和在BTIC衍生的小鼠神经胶质瘤模型中诱导了YB-1易位进入细胞核，促进了XVir-N-31复制以及随后的BTIC溶瘤。与放射治疗和基于XVir-N-31的肿瘤病毒治疗相结合的临床相关治疗策略。
　　 BTICR11，R28和R49细胞系由C.Beier博士友情提供，如先前所述从原发性GBM患者中获得，并维持为干细胞许可培养基中的肿瘤球，其中补充了人类重组表皮生长因子，人类重组碱性成纤维细胞生长因子，人类白血病抑制因子和2％B27补充剂，用于保留肿瘤的原始分子特征并最大程度地减少分化。R28通过用Lenti-mCherry转导R28细胞并随后用嘌呤霉素进行选择来生成BTIC。在感染复数5下，用编码荧光蛋白mCherry的预制慢病毒颗粒感染4×10细胞。在感染后24小时，将培养基更换为新鲜的生长培养基。感染后48小时，加入嘌呤霉素。使用ZeissAxioImagerZ1荧光显微镜，以×50的放大倍数监测选定的存活细胞的mCherry荧光。对于腺病毒感染，通过胰蛋白酶消化将BTIC球分离为单个细胞。在GammacellGC40设备中对BTIC和含有R28肿瘤球的脑切片进行辐照。
　　 在癫痫患者的手术过程中，获得了来自健康皮层区域的组织。根据先前公开的方案进行组织制备。组织小心地显微切割和只有很少使用双极钳夹的切除，以确保组织的完整性，转移到冰冷的人工脑脊液，并立即运送到实验室。将组织始终浸没在凉爽和碳化的aCSF中。在除去软的，组织块状物垂直修剪成皮质表面和250-350μ使用MICROMHM650V振动切片机制备了米厚的片。切片皮质组织后，将切片切成几块均匀大小的片。随后，将切片转移到未涂布的30mmMillicell-CM组织培养插入物的培养膜上毛孔，并保持在6孔培养皿中。对于长期培养，将板保存在从非肿瘤患者分离的人CSF中的37℃，5％CO2和100％湿度下。神经元在37℃下用NeuO。除去含NuO的CSF，并加入新鲜的CSF。为了计算组织切片中的细胞总量，根据制造商的规程，用DAPI对细胞核进行染色。使用ZeissAxioImagerZ1荧光显微镜以显微镜放大倍数为50倍获得Z堆栈。使用ImageJ软件对核进行计数。为了将BTIC植入组织切片中，使用了大小为20至50个细胞的R28球。是使用10下显微观察手动地执行注入μ升移液管尖端。切片和球体在补充重组人bFGF和EGF的人CSF中生长长达23天。每3天更改一次CSF。长如果肿瘤区域达到照相可检测区域的边界，则将最高可测量值用于定量。
　　 制备，纯化和滴定XVir-N-31。使用具有绿色荧光蛋白的腺病毒来确定R11，R28和R49BTIC的转导效率，该腺病毒具有与XVir-N-31相同的RGD-基序修饰的衣壳。通过向生长培养基中加入适量的病毒进行感染。感染后48小时，通过胰蛋白酶处理将细胞分离成单个细胞，并通过流式细胞术分析GFP的表达。使用Summit软件在CyanADP流式细胞仪上进行分析。针对每个体外实验优化了使用XVir-N-31的BTIC的MOI。如上所述进行感染。72小时后，整理细胞和培养基并制备冻融裂解物。使用Adeno-Rapid-X-Titration试剂盒在293细胞中确定这些裂解物中的病毒滴度。
　　 如先前所述制备总细胞裂解物。所述的方案制备核蛋白和胞质蛋白裂解物。如先前所述进行蛋白质印迹分析。
　　 将小鼠饲养在研究所的动物设施中的IVC笼中。每周监测动物健康和行为3次。在肿瘤细胞植入后第11天，将30只注射肿瘤细胞的小鼠随机分成四组。使用LINAC线性加速器对两组共进行了3Gy的肿瘤照射，并于第二天接受瘤内注射PBS或1.5×10感染单位XVir-N-31。一组仅接受XVir-N-31，一组接受颅内PBS注射。通过致命的CO2吸入使小鼠安乐死与肿瘤相关的症状发作。人类终点是根据地区议会批准的N12/14评分表定义的，包括偏瘫或截瘫，发作性疾病，步态障碍或体重减轻>19％的较早发作。缺乏呼吸和褪色的眼睛证实了安乐死。150天后，实验由存活动物的安乐死终止。所有动物研究均根据德国动物福利法及其关于实验动物的护理和使用指南进行，蒂宾根州区域委员会。
　　 用于建立神经胶质瘤和乳腺癌细胞系中，已经证明，照射导致YB-1的易位到细胞核。检查了在耐TMZ的BTIC中是否也是如此。使用3条不同的BTIC谱线，海外医疗网的研究人员在照射后8h鉴定出细胞中总YB-1的上调，但程度不同。使用核和细胞质细胞提取物，可获得更高分子量的附加YB-1谱带，但未照射的对照细胞中未检测到。在R11细胞中，该条带存在于受辐照和未辐照细胞的核提取物中。在R49细胞中，在照射后24小时以高水平检测到另外的YB-1蛋白变体。已经确定，在应激刺激下，如辐照，YB-1蛋白将被翻译后修饰，所有YB-1条带均用于定量核YB-1的量。辐射的R28和R49细胞中的核YB-1水平均升高。仅2Gy的剂量就足以将YB-1重新定位到R28细胞中的核中，而6Gy的剂量则是使RB-1在R49细胞中进行核移位所需的剂量。在R49细胞中，高度翻译后修饰的YB-1YB-1在高水平下显着，在R11和R28细胞中均未观察到。在R11细胞中未观察到相关的核YB-1水平升高，也未观察到YB-1条带，与R28和R49细胞相比，它们具有较高的基础YB-1核水平。还使用6Gy的剂量辐照R11和R28细胞。但是，该照射剂量并未增加R11或R28细胞中的核YB-1水平，甚至没有诱导R28细胞中的细胞死亡。
　　 尽管由于在独立实验中病毒产生的高度变异性，该水平并不显着，但R28和R49细胞中YB-1的核易位，特别是YB-1核的水平与增强在这些细胞中产生XVir-N-31。使用1个MOI的XVir-N-31联合照射和感染R28和R49细胞时，病毒的产生几乎没有增强，而3个MOI感染的R49照射的XVir-N-31产量的增加是1.6-130倍取决于照射剂量，并且优于在R28细胞中观察到的。在R28细胞中，剂量为6Gy的辐射导致细胞死亡，同时导致病毒产生减少。如预期的那样，在辐照的R11BTIC中，其基础核YB-1的表达较高，但是没有相关的辐照介导的YB-1的核转移，未检测到XVir-N-31的产生明显增强。为了分析放射线和基于XVir-N-31的联合病毒疗法在耐药BTIC中的作用，建立了器官型体外神经胶质瘤模型，其中将R28球植入人皮层脑组织切片中。切片用3Gy辐照，用5×10IFUXVir-N-31感染，或辐照并在24小时后感染。在14天内量化肿瘤球的生长。不可能进行更长的量化，因为大多数肿瘤球体的尺寸在此时间点后扩大了显微镜观察区域。所有未经处理的对照R28肿瘤球生长迅速，而单独照射或感染导致球生长速度下降。通过XVir-N-31的单次感染，几乎完全抑制了3/6球体的生长，而3/6球体继续生长，但与对照相比程度较小。许多肿瘤细胞表现出溶瘤腺病毒感染的典型特征，包括减小的细胞大小和圆形的细胞形状，表明这些细胞正在死亡。当将辐照用作单一处理时，所有球体的生长都会延迟。但是，存活的肿瘤细胞以高度侵入性的方式生长到脑组织中。相比之下，联合治疗非常有效并且显着延迟了肿瘤球的生长。处理后1/6球几乎被完全根除，2/6球显示出高度延迟的生长，而3/6球生长缓慢。因此，评估了这些缓慢生长的球体的形态。在这些领域中，许多细胞表现出溶瘤的特征，可见继续增殖的未感染的存活肿瘤细胞群。
　　 令人鼓舞的体外结果促使对基于XVir-N-31的联合癌病毒照射疗法在小鼠中的治疗效果进行分析。为此，将R28BTICs颅内植入裸鼠的纹状体中。对小鼠进行如下处理：i）假手术ii）24小时后照射+瘤内PBS注射iii）XVir-N-31。该病毒数量代表最近确定的有效治疗剂量的一半iv）24小时后联合。为XVir-N-31和Combi组选择了次优剂量的XVir-N-31，以确定在感染前通过肿瘤照射可能会增强XVir-N-31的溶瘤作用。在假手术处理的小鼠中肉眼观察到大肿瘤，并且这些动物在第85天左右死去。与对照组相比，单个治疗组的平均存活期增加，但是两个单药组的平均存活率几乎相同-疗法。与辐照组相比，病毒治疗组的中位生存期有所改善，但没有达到显着水平。采用次优量的感染性XVir-N-31颗粒进行肿瘤病毒疗法的中位生存期未达到?120天。在接受肿瘤照射后再进行肿瘤病毒治疗的小鼠中，存在存活期延长的趋势，尽管这没有达到显着意义。该组中位生存期为101天，平均生存期为108天。该组中的一只小鼠即使在植入肿瘤后的150天也没有表现出任何与肿瘤相关的症状。处死该小鼠，但未检测到可见的肿瘤。
　　 BTICs的辐射增强了依赖YB-1的溶瘤腺病毒XVir-N-31的裂解活性。BTIC是具有高度抗药性的细胞，具有干细胞特性，已被提议作为负责疾病引发及其复发的原始细胞。由于没有足够的治疗方法可有效治疗复发性神经胶质瘤，结果可能对未来联合治疗策略的发展产生重大影响。确定了BTIC中XVir-N-31的作用，并证明XVir-N-31在BTIC中复制。在BTIC衍生的小鼠神经胶质瘤模型中，一次静脉内注射XVir-N-31可以显着延长小鼠的生存期。XVir-N-31复制取决于核YB-1的存在。YB-1主要在所有高级别神经胶质瘤中表达，传达对TMZ的耐药性，并作为肿瘤进展的预后生物标志物。但是，在某些BTIC中，只有少量的YB-1被鉴定为有核的，因此病毒复制是次优的。，YB-1响应遗传毒性胁迫，被翻译后修饰并从细胞质转移到细胞核中。这又增强了复制和在建立的肿瘤细胞系和神经胶质瘤的实验模型XVir-N-31的溶瘤作用。由于癌病毒疗法仍不是治疗神经胶质瘤的标准疗法，因此有望将其主要用作复发性神经胶质瘤的二线治疗。正如已经确定的那样，建立的神经胶质瘤细胞系的辐射诱导YB-1易位到核中并支持XVir-N-31复制，研究人员假设在肿瘤病毒疗法之前进行辐射可以增强XVir-N-的治疗效果基于31的复发性神经胶质瘤患者的Oncovirotherapy。为了检验这一假设，研究了辐射对BTICs，复发性神经胶质瘤中的主要靶细胞和驱动程序的BTICs中YB-1亚细胞定位的影响。在R28和R49BTIC中检测到核YB-1升高，但是在R11细胞中未观察到辐射介导的YB-1核易位。与R28和R49BTIC相比，观察到R11细胞具有较高的基础核YB-1基础水平。该观察结果与先前的数据不一致，后者揭示了R11细胞中同时存在细胞质YB-1和核YB-1，但这可以通过在这些研究之间使用不同的YB-1抗体来解释。然而，R11BTIC中核YB-1的基础水平很高，可以解释为什么这些细胞比R28和R49细胞具有更高的基础XVir-N-31复制速率，为什么核YB-1水平没有进一步增加在辐照这些细胞后，研究人员发现了这种现象，以及为什么辐照不能增强XVir-N-31的产生。R49细胞需要更高的辐照剂量才能启动YB-1进入细胞核的转移。与在R49和R28BTIC中观察到的YB-1核水平升高相一致，感染前的辐射促进了这些细胞中XVir-N-31的产生，最高可达130倍。但是，病毒产生的诱导是可变的。由于YB-1充当应激蛋白，其翻译后修饰和核易位以及因此作为XVir-N-31复制所必需的转录因子的活性对外部条件非常敏感。另外，病毒生产本身是一个复杂的过程，包括病毒蛋白的转录，DNA复制以及病毒蛋白和基因组的自组装，以产生感染性病毒颗粒。
　　 与R28细胞相比，在辐照后表现出更高XVir-N-31产生的R49细胞中，存在核YB-1，这表明它是YB-1的高度翻译后修饰形式，被检测到。不仅YB-1的核易位，而且其翻译后修饰对于其作为XVir-N-31复制所必需的转录因子的功能也很重要。是否该变形例中仅包括磷酸化或乙酰化还或SUMO化，甚至是目前未知的修改，都需要进行额外的研究。总而言之，来自本研究的数据表明，核YB-1和XVir-N-31复制与其在已建立的肿瘤细胞系中的产生之间存在直接关联，这与研究人员先前的观察一致。在携带R28神经胶质瘤球体的人类皮质脑切片以及带有R28胶质瘤的小鼠中评估了基于XVir-N31的联合病毒免疫放疗的治疗效果。用次适量的XVir-N-31，以确定辐射和病毒感染的协同效应。选择病毒感染的特定时间点，因为在此期间后可检测到核YB-1水平升高。由于XVir-N-31还可以感染神经元，神经胶质细胞和星形胶质细胞，所选病毒剂量仅相当于IFU细胞。基于XVir-N-31的单一疗法的治疗效果仅中等。但是，R28的延迟即使在此浓度下，也可检测到肿瘤球体的生长。总共3/6个分析的球状体显示出明显的生长延迟，其他的则有中等程度的延迟。增长率的变化不仅可能是由病毒感染引起的，而且还可能是由于植入的椭球体大小不一而引起的。在XVir-N-31感染的组织中观察到溶瘤性细胞病变作用和垂死的BTIC，如圆形细胞形状和球体中细胞碎片的出现所表明。辐照也延迟了BTICs的生长，但是没有观察到死细胞，并且存活的细胞大量侵袭周围的脑组织，这种作用在过去已经在神经胶质瘤细胞中描述过。相比之下，辐射与XVir-N-31感染的结合显着降低了R28肿瘤球状生长。虽然1个球状体根本不生长，但2个球状体表现出了巨大的增长，而3个球状体的增长却明显下降。该效果似乎与单独的辐射效果相当甚至超过。然后用显微镜检查了生长明显减少的球体的结构，并检测了许多死细胞和细胞碎片。在这些样品中观察到已经开始分裂的活细胞，但是在处理之后的某个时间点。联合治疗后肿瘤细胞的长出可能是由于用于治疗小球体的感染性XVir-N-31含量低以及某些细胞可能根本没有被感染而引起的。先前已在小鼠神经胶质瘤模型中在体内确定了基于XVir-N-31的癌病毒疗法的治疗效果，其中已证明，需要?3×108IFUXVir-N-31才能显着降低肿瘤的生长，从而导致显着延长生存期。要确认的组合oncoviro放疗的治疗效果，如在R28中观察到BTIC衍生神经胶质瘤含有器官型脑培养物在体外，并表现出肿瘤照射对溶瘤作用介导的肿瘤细胞死亡的支持，并且因此对肿瘤生长和存活率，仅次优的XVir-N-31肿瘤内注射到疾病模型中。该病毒剂量本身不能显着延长生存期。此外，在感染前通过单次3Gy肿瘤照射进行放疗，这是在对神经胶质瘤患者进行部分照射时使用的剂量。但两个单药治疗组的平均生存期均延长了10-11天。接受癌病毒辐照治疗的小鼠的存活率反而增加了23天。确定了该组的中位生存期，与单药治疗相比，联合治疗表现出更好的疗效。肿瘤照射和基于XVir-N-31的在线病毒疗法相结合所获得的效果在统计学上并不显着，但是在治疗性神经胶质瘤小鼠模型中使用了次适量的放射剂量和XVir-N-31。假设优化治疗方案，例如重复照射和注射治疗相关剂量的XVir-N-31，可能会导致该组合对肿瘤生长和生存的改善作用。
　　 尽管辐射和溶瘤腺病毒之间的相互作用很复杂，但是鉴于细胞对辐射的反应的多样性以及癌病毒介导的抗肿瘤免疫作用的多样性，YB-1的辐射介导的翻译后修饰及其核转运是由于其中心的在XVir-N-31复制中的作用可能解释了联合抗癌放射疗法在目前使用抗药性BTICs建立的神经胶质瘤小鼠模型中的优越效果。本研究的结果表明，应在基于XVir-N-31的covirovirotherapy之前对复发性神经胶质瘤患者进行放射治疗，以优化这些患者的溶瘤病毒疗法的效果。将合并的无线电oncovirotherapy治疗可以进而支持的患者复发GBM治疗结果。