高级别脑胶质瘤占成人恶性原发性脑肿瘤的70％。胶质母细胞瘤是最恶性，也是最常见的实体。在基于人口的研究中，患者的存活率达到大约一年。O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶启动子的甲基化状态是GBM患者的独立预后因素，并预测对烷基化剂治疗的反应更好。NOA-08研究证明基于毫克MT状态的治疗决策的价值。CeTeg/NOA-09试验还显示烷基化联合疗法的疗效提高，带有甲基化毫克MT启动子的GBM患者的总体生存期延长。毫克MT启动子甲基化目前是神经肿瘤学中最常用的分子诊断分析之一。然而，可以使用多种不同的方法来分析该标记，并且目前正在使用这些方法。可以使用各种分析技术评估不同的组织制剂，无论其是天然的，冷冻保存的还是福尔马林固定的。这些方法包括酶活性，免疫组织化学或DNA测试，以评估毫克MT启动子的甲基化状态。在进行分子诊断之前，必须确保组织质量和肿瘤细胞含量以及DNA质量。福尔马林固定和石蜡包埋是最广泛使用的保存组织以用于诊断目的的技术。因此，使用FFPE组织的方法最适合临床环境。
　　 对DNA甲基化特异性测定进行分类，无论它们产生定性结果还是定量结果。所有基于DNA的诊断测定都需要亚硫酸氢盐转化步骤，其中亚硫酸氢盐将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而保护5-甲基-胞嘧啶免受这种转化。甲基化特异性聚合酶链反应使用甲基化特异性引物组。将PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，得到甲基化和非甲基化模板的不同高度的条带。研究人员必须将这些定性解释为甲基化，非甲基化或非结论性的。解释方法包括观察者间差异的可能性。MS-PCR是选择在最重要的患者队列研究方法，但有在该方法本身绘制后卫。通过热测序的DNA甲基化分析给出毫克MT启动子甲基化状态的定量结果。确切的CpG位点在不同引物组之间有所不同，必须在每次测定之间建立用于解释的临界值。作者讨论不同的临界值的必要性。作为一种替代方法，基于磁珠阵列的技术正在进入诊断领域。通过IlluminaInfinium人类甲基化450珠芯片阵列以及最近使用更新的EPIC阵列，利用高密度DNA甲基化阵列对DNA甲基化模式进行表观基因组范围的分析，在脑肿瘤研究中受到越来越多的关注。来自FFPE组织的肿瘤DNA与这些阵列的杂交允许甲基化分布在整个基因组中的大于450,000CpG位点。可以从基于甲基化的技术中获得其他有用的诊断信息，方法是计算拷贝数图或将其分类为诊断性DNA甲基化类别。它进一步允许分析毫克MT启动子的甲基化状态设计的STP-27算法。该算法基于逐步逻辑回归模型，并分析毫克MT基因区域内的两个不同的CpG位点，导致甲基化，非甲基化或不确定的分类。有关通过此处介绍的方法分析的不同CpG站点的概述。尽管如此，目前有各种方法可用于不同的实验室。因此，建立标准方法和临界值对于可靠的患者治疗分层很重要。
　　 甲基化特异性PCR与83例高级别胶质瘤患者样本中的闭管高分辨率熔解分析和焦磷酸测序进行了比较。由于HRM的简单性，成本效率，准确性和速度，它们比MS-PCR和热测序更适合HRM。此外，与MS-PCR相比HRM在预测神经胶质瘤患者的总体生存方面具有优势。另一组在八个中心比较139例冷冻和FFPE固定标本的胶质母细胞瘤患者的热测序和半定量MS-PCR。实验室间的一致性最高，另一个小组可以证明，定量MS-PCR是病理实验室常规使用的一种快速有效的检测方法。他们使用焦磷酸测序，免疫组织化学，定量MS-PCR，甲基化敏感性HRM和下一代测序比较350例神经胶质瘤和神经胶质瘤样本的结果。一项研究比较55名患者中通过HM450K进行STP-27与甲基化特异性多重连接依赖探针扩增和免疫组化的结果。他们得出结论，两种方法具有同等价值。在这项研究中，评估从HM450K获得的STP-27与经典MS-PCR相比，毫克MT启动子甲基化分析的有效性。通过焦磷酸测序验证不一致的结果。队列包括39例IDH野生型胶质母细胞瘤患者。通过基于DNA甲基化的分类在分子上证实了该诊断。还分析GBM样本中10号染色体的频繁丢失是否影响了这两种方法的准确性。出国看病网研究的目的是分析日后使用和减少偏倚的高密度DNA甲基化阵列技术是否能够替代MS-PCR。
　　 来自世界卫生组织IV级IDH野生型胶质母细胞瘤患者的FFPE样本来自德国美因河畔法兰克福大学医院神经病学研究所以及德国埃伯哈特-卡尔斯大学病理学和神经病理学研究所以及图宾根综合癌症中心-德国图宾根的斯图加特。由至少两名经验丰富的神经病理学家进行神经病理学诊断。共有39名确诊为成人IDM野生型GBM甲基化特征的患者进入研究。该队列包括14名女性和25名男性患者。中位年龄为61岁。年龄最小的患者为39岁，年龄最大的为86岁。34名新诊断的GBM患者和5例复发的GBM患者进入研究。通过开放手术收集了33个样本，而通过立体定向活检则获取6个样本。有关摘要信息，患者材料的使用已获得德国歌德大学伦理委员会的批准。神经病理学评估基于HE染色以及针对神经胶质原纤维酸性蛋白，突变特异性异柠檬酸脱氢酶1R132H，增殖标记Ki67和微管相关蛋白2的免疫组织化学染色。所有病例均为IDH1_R132H阴性，GFAP在不同程度上呈阳性，而MAP2主要在细胞过程中异源表达。Ki67增殖指数介于3％至15％之间。
　　 对于每种情况，选择显示最大数量的重要肿瘤组织的石蜡块进行甲基化特异性聚合酶链反应。如果中枢神经系统组织或广泛坏死区域突出，可以通过显微解剖来提高样品质量。从每个石蜡块上切下四个厚度为10μm的载玻片，以用于整个样本。大约十个或更多患者样本。1毫米3通过立体定位活检收集。在这些情况下，汇集每位患者的三到四个活检标本。通过在二甲苯和96％乙醇中反复洗涤，将载玻片脱蜡。在法兰克福，使用EpiTectFastLyseAllBisulfiteKit进行了DNA分离。在ThermocyclerT3000上进行PCR。对于甲基化的毫克MT序列，预期有122bp的片段，而非甲基化的毫克MT序列的扩增产生了129bp的片段。在每个MSP运行中，将来自神经胶质瘤细胞系LNT229的DNA用作甲基化毫克MT启动子的阳性对照，将来自健康志愿者供体的DNA用作非甲基化毫克MT启动子状态的阳性对照，并将H2O用作阴性控制。MS-PCR后，将每个样品20微升在120V的2％琼脂糖凝胶上加载35分钟。根据制造商在德国海德堡德国癌症研究中心的基因组学和蛋白质组学核心设施中的说明，使用HM450K阵列获得482,421CpG位点的DNA甲基化状态。考虑到cg12434587和cg12981137，使用STP-27算法计算毫克MT基因内CpG岛的甲基化。使用商购的热解测序试剂盒PyroMarkQ24根据制造商的说明进行热解测序，该定量试剂盒可定量毫克MT基因第1外显子的+17至+39区域的甲基化水平。在德国海德堡大学神经病理学系进行了焦磷酸测序。使用焦磷酸测序检查了与进行STP-27分析相同的DNA提取。对于序数比例变量的相关分析，出国看病网使用了科恩的kappa相关分析。对于所有测试，选择显着性水平α=0.05。使用JMP11.0软件和Prism6进行统计分析。
　　 至少有两名经验丰富的神经病理学家对所有病例进行了组织病理学诊断，并使用发表的基于DNA甲基化的分类方法，通过高密度甲基化谱进行了验证。仅成人IDM野生型GBM的甲基化特征得到确认的病例才进入研究。划分为子组看到10％GBM_MES，15％GBM_RTK1、20％GMB_RTK2和54％MCF_GBM。如果样本的分类器值属于不单独达到阈值的各个GBM子组，则将其分类为MCF_GBM。比较这两种独立且与方法学无关的方法的结果。在所有39个患者样本中，MS-PCR将12例分类为“甲基化”，将24例分类为“未甲基化”，将3例分类为“不确定”。STP-27将14例分类为“甲基化”，将21例分类为“未甲基化”，将4例分类为“不确定”。仔细观察数据，在12例“甲基化MS-PCR”病例中，有10例被STP-27分类为甲基化，而2例被STP-27分类为“不确定”，没有矛盾的情况。MS-PCR将3种情况归类为“不确定”，其中STP-27将其中2种归类为“甲基化”，其中一种归类为“未甲基化”。MS-PCR认为所有“不确定”的病例均由STP-27明确分类。在MS-PCR的24个“非甲基化”病例中。因此有两个案例是矛盾的。总体一致性率从所有一致病例的77％到甲基化病例的83％和非甲基化病例的86％。卡伯系数为0.58。
　　 出国看病网对所有病例进行了亚组分析，两种方法均显示出结论性的预测。因此，以两种方法中的任何一种对所有情况进行“不确定”或“不确定”结果的审查。审查后，仍有32例案件需要进一步分析。MS-PCR将10例病例归为“甲基化”，其中所有病例也被STP-27归为“甲基化”。MS-PCR通过STP-27将22个病例分类为“未甲基化”，其中20个分类为“未甲基化”，两个分类为“甲基化”。如果根据MS-PCR获得“未甲基化”的结果，则有91％的案例与STP-27的结果一致，卡帕系数为0.86，这说明了方法间的高度可靠性。在两种情况下，在MS-PCR和STP-27之间收到矛盾的结果。重新检查组织质量和肿瘤细胞含量以及程序规程，没有发现技术故障或担忧。作为另一种独立且与临床相关的方法，进行甲基化特异性焦磷酸测序，以评估毫克MT启动子的甲基化状态。Quillien提出了三个热解测序的临界值：低于8％的第一组对应于较低的甲基化水平和较差的存活率；第二组高于12％对应于“甲基化”和更高的总生存率。他们建议第三组在9-12％的范围内为灰色区域，而替莫唑胺治疗“不确定”意义不明显。1例是“未甲基化的”；另一种情况是根据焦磷酸测序“甲基化”。在情况32中，热解测序有利于MS-PCR，在情况34中，热解测序有利于STP27。
　　 癌细胞中经常发生的染色体畸变可能会影响基因诊断的准确性。毫克MT基因位于10号染色体上，在GBM癌细胞中经常是单合的。这可能会不同地影响测试方法。在出国看病网队列中，所有病例的85％中仅看到一个10号染色体拷贝。关于小组人数少，结果“不确定”或“不确定”与MS-PCR或STP-27缺失10号染色体没有显着相关性。比较STP-27的数值是否与10号染色体状态有关。将“甲基化”和“非甲基化”组的差异的平均值重新排列为“染色体10的一个拷贝”和“染色体10的两个拷贝”。用Welch校正对不同组别进行的t检验，STP-27的数值与10号染色体状态之间没有统计学上的显着差异。染色体丢失不影响毫克MT启动子的甲基化结果。
　　 在这项研究中，比较STP-27与MS-PCR预测毫克MT启动子甲基化状态的结果。两种方法都需要具有一定数量肿瘤细胞的肿瘤组织。研究临界点是70％的肿瘤细胞含量。MS-PCR需要几个手动工作步骤，通常可以在一到两天内连续执行。要最终读取PCR产物泳道，需要对可能受到主观偏见影响的琼脂糖凝胶进行视觉解读。在大多数执行MS-PCR的中心，每周进行一次毫克MT启动子甲基化测定。除了执行检测的技术人员外，成本也很低，并且所需的设备是大多数神经病理学实验室标准基础设施的一部分。相反，STP-27需要高分辨率的DNA甲基化阵列和专门的读出分析仪器。可以通过在线开源评估生物信息学分析工具。当前可用的DNA阵列提供了八个样品插槽，如果不能使用所有插槽，则会增加成本，分析的手动部分至少需要四天。由于测定的设计和可靠的方法，HM450K或EPIC可提供非常高的结果重现性。单个毫克MT启动子甲基化分析的费用肯定比MS-PCR产生的费用高，但是基于阵列的分析还提供了有关不同分子脑肿瘤类别和全基因组拷贝数信息的其他信息。使用EPIC似乎可以回答重要的诊断问题，然后可以作为次要结果来回答毫克MT启动子的甲基化状态。总体而言，两种方法均提供高度一致的结果。在检查两种方法之一中所有非结论性病例后，在设置“甲基化”毫克MT启动子时，两种方法完全匹配。在“非甲基化”毫克MT启动子的背景下，重叠率为91％。尽管通过分光光度法进行适当的DNA纯度测量，但DNA质量受损仍可能是造成这种差异的一种解释，如在两种情况下所见。根据焦磷酸测序，这两种情况要么被甲基化，要么未被甲基化，这两种方法都具有价值，或者需要进一步改进两者。
　　 如果STP-27导致毫克MT启动子甲基化状态“不确定”，两个中心将定期执行焦磷酸测序，并依赖于焦磷酸测序的结果。一个中心会诊断为“非结论性”，特别是如果基于DNA甲基化的分类将组织指定为非肿瘤脑组织，似乎在他们的手中相连。在肿瘤委员会中跨学科制定治疗决策；通常这些患者被视为“未甲基化”。这种途径是否正确，必须由进一步的研究和神经肿瘤专责小组来确定，特别是因为有些作者报告了毫克MT启动子甲基化程度低的灰色区域，对替莫唑胺有一定的敏感性。与MS-PCR相比，STP-27导致甲基化结果的可能性较高，而未甲基化结果的可能性较低。STP-27通常将结果归类为“不确定”，这可能是由于Quillien提出的诊断不确定性和“中间”甲基化存在的程度更好。一些研究解决毫克MT启动子甲基化状态不确定的问题，重复测量后结果变化或用不同方法测量后结果变化。在465名GBM患者队列中，MS-PCR分析58例胶质母细胞瘤的毫克MT启动子甲基化状态尚无定论。他们报告这些患者的总体生存能力较差，并假设在甲基化程度不一致的GBM中，患者的生存率与甲基化程度之间存在剂量反应关系。此外，他们讨论重复毫克MTMS-PCR测试中导致不一致结果的可能原因的技术因素。还报告甲基化程度与总生存率之间的相关性。最近毫克MT启动子甲基化的“灰色区域”–这些患者似乎赋予替莫唑胺治疗某些敏感性。
　　 MS-PCR和STP-27均提供定性结果。热解测序产生一定百分比的甲基化DNA，必须借助临界值对其进行解释。这些必须明智地选择。在环境中使用焦磷酸测序时，“未甲基化”的甲基化临界值低于8％，“甲基化”的甲基化临界值高于12％，“不确定”的中间范围结果。这些截止值近似于总体存活的预测模型。如果不考虑不同的CpG岛的影响，在使用不同的测定方法时会有所不同，那么使用焦磷酸测序法对甲基化毫克MT启动子的临界值进行比较是不可能的。出国看病网进一步分析了0号染色体的状态是否会影响“不确定”或“不确定”结果的频率。在队列中第10号染色体的拷贝数对任一检测结果均没有独立影响，这与Bady的结果一致。然而，研究反映诊断材料存在的问题，这些问题包括样品质量，肿瘤含量和DNA质量各不相同，所有这些都会影响分析结果。通过STP-27/HM450K预测毫克MT启动子甲基化状态似乎比MS-PCR略有优势。STP-27/HM450K是确定胶质母细胞瘤患者毫克MT启动子甲基化状态的高度可靠且可重复的方法。尽管总体一致性较高，但错误分类病例的比率相同，但STP-27在较高程度上标记为“不确定”结果。尽管STP-27方法的成本明显较高，但该方法从肿瘤组织中提取了更多的信息。由于可以从基于阵列的表观遗传学分析中推断出许多其他标志物和结果，因此该方法似乎很有希望，也遵循2016年WHO对脑肿瘤分类提出的针对脑肿瘤的分子分类系统。