神经营养性原肌球蛋白受体激酶是跨膜酪氨酸激酶家族，在神经发育中起重要作用。该家族的三个成员TRKA，TRKB和TRKC分别由NTRK1，NTRK2和NTRK3基因编码，分别由胞外配体结合结构域，跨膜区和细胞内激酶结构域。通常，受体通过配体结合的生理激活会激活激酶结构域，从而导致受体均二聚化，磷酸化和下游信号通路的激活。尽管高度同源，但每个受体都有一个优选的配体：TRKA对神经营养蛋白神经生长因子具有最高的亲和力，TRKB对脑源性神经营养因子和Neurotrophin-4具有最高的亲和力，TRKC对Neurotrophin-3具有最高的亲和力。许多剪接变体已被表征，特别是涉及NTRK1，并且无论是在正常组织和在人类癌症如神经母细胞瘤和急性骨髓性白血病，其中可以认为，它们可以在肿瘤发生发挥作用，这些变体已经被观察到的。虽然一些研究已经确定了NTRK中的体细胞点突变或扩增迄今为止，尚未证明这种改变是致癌作用的驱动因素。
　　 原肌球蛋白受体激酶受体的组成性激活和随后的下游途径可通过染色体倒置，缺失或易位而发生，导致任何NTRK基因的C端酪氨酸激酶结构域与N-终端融合伙伴。已经描述许多5'融合伴侣，并且在几乎所有情况下，融合消除了配体结合位点，导致不依赖配体的二聚化和磷酸化。第一个TRK融合蛋白最初是在结直肠腺癌细胞系中描述的，但是即使在发现时，也已经认识到这种特定癌基因参与这种融合是结肠癌中罕见的事件。它被发现，婴儿纤维肉瘤的特点是一个ETV6-NTRK3融合涉及染色体12的易位和15，并随后也在乳腺和唾液腺，现在定义的分泌性癌报道此相同的融合癌的这些子集。NTRK融合在甲状腺癌的一部分中也有报道，特别是在有放射史的患者中，在许多其他肿瘤中也很少发现它们，包括肺癌，神经胶质瘤，其它肉瘤，炎性肌纤维母肿瘤和黑素细胞瘤。近年来，临床试验已从起源部位和组织学亚型特异性设计转移到篮筐试验，该试验旨在测试针对特定分子机制的疗法，而针对NTRK融合的试验尤其如此成功。在这样的近期试验中，拉罗替尼对具有NTRK融合蛋白的局部晚期和转移性实体瘤显示出显着且持久的疗效。Entrectinib针对活性NTRK融合以及涉及融合ROS1和ALK，还在最近的临床试验中示出大的功效。larotrectinib的成功导致了美国食品和药物管理局在其随后的快速批准，因此护理标准现在需要谁能够从这种做法改变治疗中获益的患者准确的识别。
　　 免疫组织化学检查蛋白质表达具有几个优点。它通常在临床实验室中使用，因此实现和验证相对简单。它还具有价格便宜，仅需一张未染色的载玻片并具有快速周转时间的优点。最常使用和研究最深入的克隆是克隆EPR17341，它与来自TRKA，TRKB和TRKC的C端的保守专有肽反应，因此可与任何致癌物质发生反应NTRK融合。阳性染色被定义为至少1％的肿瘤细胞中高于背景的染色。初步研究表明，敏感性在75％至96.7％之间，特异性在92％至100％之间[24-27]。但是染色强度已显示为可变的，且染色模式与融合伴侣相关。与天然TRK的膜相关表达相反，融合伴侣可以指导融合蛋白定位于其他细胞区室。研究表明NTRK3融合蛋白的敏感性降低了。根据经验，例如发现NTRK1和NTRK2融合的敏感性分别为96％和100％，而NTRK3融合的敏感性为79％。另外，根据肿瘤类型，免疫组织化学似乎具有可变的特异性。尽管该抗体在结肠癌，肺癌，甲状腺癌，胰腺癌和胆道癌中似乎具有100％的特异性，但在乳腺和唾液腺癌中却发现特异性降低，因为偶尔会看到细胞质染色。特异性是肉瘤较低，特别是那些与神经或平滑肌分化与野生型蛋白TRK在神经生理学上表达和平滑肌组织。
　　 NTRK融合阳性肿瘤的免疫组织化学染色模式:唾液腺的ETV6-NTRK3融合癌显示出弱至中度的核和细胞质染色。肝内胆管癌与PLEKHA6-NTRK1融合显示膜突出染色。具有LMNA-NTRK1融合蛋白的胆囊腺癌显示出强烈的细胞质和核周染色。通过TPM3-NTRK1融合体转移至软组织的甲状腺癌显示出强的细胞质和膜性染色。荧光原位杂交可以在DNA水平上检测到较大的结构变异，通常在临床实验室中用于检测实体瘤中的致癌融合。商业广告时段开的探头可用于ETV6基因，其中在所述着丝粒3绿色信号'的末端的分离ETV6，并且在5橙色信号'的末端ETV6指示涉及的结构变体基因。在组织学上提示ETV6-NTRK3融合的情况下，例如婴儿纤维肉瘤，先天性中胚层肾瘤或唾液腺或乳腺分泌性癌，此类检查可用于确认易位。由于其他癌症中的融合可能通过平衡或不平衡的易位或大缺失而涉及任何NTRK基因和许多伙伴中的任何一个，因此仅检查ETV6基因会错过许多致癌的NTRK融合。为此，对于三个破开的探针NTRK基因已被用于识别融合物和可商购自多个来源。从理论上讲，分离探针对染色体异常具有足够的敏感性和特异性，但在解释分离FISH分析中有实际的技术考虑。在研究中，短反转和染色体内易位涉及使用分离探针，ALK导致了较短的分裂长度。这些短的分裂长度很难与某些正常细胞中的分裂长度区分开，因此可能导致假阴性结果。这些发现与NTRK1融合特别相关，其中大多数是涉及染色体1的染色体内事件。例如，LMNA-NTRK1融合是通过染色体内缺失形成的，由于信号分裂不充分，可能导致假阴性的FISH。另外，尽管断裂探针的阳性结果表明存在涉及所探查的基因的结构变体，但是不能确定异常是否导致功能性转录融合体。FISH的优点包括所需的材料量仅为少量未染色的载玻片-通常每个探针检测一个未染色的载玻片-并且周转时间通常仅为几天。
　　 逆转录酶聚合酶链反应可用于检测转录的RNA的存在，并且可以定性或定量地用于检测已知两个融合伴侣的单个致癌融合的存在。但是对于NTRK融合，由于涉及的融合伙伴数量和断裂点数量众多，因此RT-PCR对单个融合转录本的实用性受到限制，并且过去主要用于检测规范的ETV6-NTRK3融合。即使此方法可能难以获得直接的融合证据，但RT-PCR仍可用于检查基因的5'端与3'端表达的差异，这已证明与存在有关易位。对于在大多数正常组织中不表达的NTRK，其3'激酶结构域的转录水平将比具有NTRK融合蛋白的肿瘤组织中的5'细胞外结构域的转录水平高得多。因此，这种测定法可以提供NTRK融合的间接证据。
　　 在基于DNA的下一代测序中，从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取肿瘤DNA，然后进行测序以研究肿瘤中是否存在特定的改变。尽管有许多不同的文库制备和测序解决方案可用，但是有两种主要方法可以分离感兴趣的基因进行测序。基于扩增子的方法使用PCR引物扩增感兴趣的区域，尽管该方法适用于检测一小组基因中的点突变和小插入缺失，但通常涉及内含子断点的基因融合的检测是有限的。另一方面，基于靶向杂交捕获的NGS分析使用与基因组中感兴趣区域杂交的捕获探针。这种无偏方法可对关键的癌症相关基因的外显子进行深度测序，以检测单点突变，插入缺失和拷贝数变异。另外，已知与功能基因融合有关的特定基因的内含子可以用探针平铺以检测这些重排。但是，某些内含子例如NTRK3中的内含子，非常长，因此无法覆盖。如果被覆盖，这些内含子将在面板大小中占很大比例，从而导致其他外显子区域的覆盖率降低以及总体测定灵敏度降低。此外，这些内含子区域中的一些即使被期望也不能被有效地捕获，因为它们包含不能用独特的捕获探针平铺的重复元件，不能产生可以可靠地映射回该内含子的读数。因此，如果融合断裂点涉及无法被杂交捕获探针覆盖的长内含子区域，则基于DNA的NGS的敏感性会受到影响。例如，纪念斯隆·凯特琳癌症中心使用的基于DNA的NGS分析MSK-IMPACT会询问NTRK1中的内含子3和7至12。NTRK2中的内含子15和ETV6中最常见的NTRK3融合伙伴的内含子4和5。然而，由于涉及的覆盖上述问题NTRK3内含子，涉及融合NTRK3比其他ETV6，不是由所述测定覆盖。这些考虑因素不仅限于MSK-IMPACT，因为其他广泛使用的癌症基因组也只能评估这些相同的内含子区域。
　　 基于DNA的NGS的一个缺点是，当检测到新的结构变异时，可能很难确定此类事件是否导致功能性表达融合。在这些情况下可以使用正交方法进行辅助测试，例如基于RNA的NGS。其他缺点包括周转时间，周转时间比免疫组织化学或FISH显着更长，并且测试所需的材料更多。另一方面，基于DNA的NGS测试的一个主要优点是可以查询许多基因组事件，除DNA水平的基因融合外，还可以同时直接评估点突变，插入缺失，拷贝数变异和肿瘤突变负担。使用此方法获得的信息包括MAPK驱动程序状态，可用于对任何后续测试进行分类。最后，这种方法对于监测患有NTRK融合体用于产生抗性突变。最近的研究已观察到在p.G667C和p.G595R突变NTRK1在和p.G696A突变NTRK3，为了TRK抑制剂疗法赋予抗性。因此，使用基于DNA的NGS监测肿瘤的进展对于经TRK抑制剂治疗的NTRK融合阳性癌症患者有用。
　　 与RNA相比，基于RNA的测序具有许多优势。内含子被剪接到RNA中，这消除了内含子覆盖的技术限制。此外，RNA水平融合的检测提供直接证据，表明它们是功能性转录的，对剪接序列的分析可以确定蛋白质是否会被翻译并符合读框。由于基因融合通常在组织中高表达，因此在低肿瘤纯度样品的RNA中也可以高信度检测融合转录本。可以使用几种不同的富集方法对基于RNA的NGS进行融合转录本的检测。在所有技术中，RNA库首先通过逆转录转化为cDNA。然后，对于基于扩增子的面板，PCR用于扩增目标序列。在使用标准多重PCR的测定中，必须知道驱动基因和融合伴侣，并且在测定中必须存在两种基因特异性PCR引物才能发生扩增。在使用这样的使用用于19个靶基因和94的融合伴侣之间169个基因融合引物对的面板的复用的扩增子的方法的研究中，被确定为融合的检测灵敏度为86％。但是，当合并读取的计数信息以确定5'/3'的比率时，如上文针对RT-PCR所述，灵敏度增加到100％。用于融合基因检测的更灵敏，更特异性，针对性的基于扩增子的方法是锚定多重PCR，可通过ArcherDX在市场上买到。在这项技术中，将Illumina测序接头连接到cDNA的两端。在PCR步骤中，基因特异性引物与目的基因杂交，而通用引物与连接的衔接子序列杂交。由于融合断裂点通常位于内含子内，因此基因特异性引物通常与外显子末端的区域互补，从而使PCR产物跨越外显子边界。通过使用测序的方法中，只有一个融合配偶体需要被定位的，因此，新的融合伙伴可以被表征。在SloanKettering纪念实验室，已经表明，这个技术能够灵敏和特异性地鉴定融合转录物和替代转录剪接从改变所得。
　　 也可以使用基于捕获的方法进行靶向或整个转录组测序测定。在逆转录以将提取的RNA转换为cDNA后，使用捕获探针以与基于DNA的测序相似的方法进行杂交捕获。使用这种方法，只需知道一个融合伙伴。经过临床验证的测定法OSU-SpARKFuse使用了这种方法，显示出93.3％的敏感性和100％的融合检测特异性。使用RNA的主要缺点之一是其不稳定性。可以从FFPE组织中提取RNA，但由于它易于断裂和降解，尤其是在较旧的材料中，因此需要进行足够的质量控制。质询RNA质量的方法可以是分析RNA片段大小分布并在基于定量PCR的分析中检查管家基因的扩增。为了评估测序测定的质量，可以确定RNA读数与DNA读数的比率，并检查RNA读数的测序范围和深度。最后，一些可商购的平台能够同时评估RNA和DNA。DNA和RNA文库是分开制备的，但可以在单个测序运行中组合起来进行分析。ThermoFisher的Oncomine综合检测采用了基于扩增子的技术，涵盖了161个与癌症相关的基因，检测涉及所有三个NTRK基因的融合体。根据ThermoFisher的技术规格，可使用少至三个FFPE载玻片或少至10ng的DNA或RNA进行测定。Illumina的TruSightOncology500分析法使用杂交捕获技术来询问涉及523个与癌症相关的基因的DNA水平改变，还对RNA转录本进行测序，以检测涉及55个基因中的任何一个的融合，包括所有三个NTRK基因。虽然不能低估确定可从靶向治疗中受益的患者的重要性，但在创建测试算法和指南时也应考虑可行性和经济因素。分类样本不仅应基于肿瘤类型及其对NTRK融合的检测前可能性，还应基于临床验证的方法学的有效性以及其阳性和阴性预测值。难以提出适合所有临床情况和实验室的综合诊断算法，并且取决于所有这些因素。在此基于一些罕见的癌症类型通常带有NTRK的观察结果，讨论考虑因素。融合，而常见的癌症类型很少包含NTRK融合。但是就绝对数字而言，后一组对大多数NTRK融合患者有所贡献。
　　 NTRK测试的诊断算法。基于组织学优先分配应首先进行以分离罕见的癌症亚型中通常具有NTRK从那些具有低预测试概率融合NTRK融合。在通常具有致癌性NTRK的肿瘤中融合，可以使用确认方法。在分泌型癌中，可以使用pan-TRK免疫组织化学作为初始筛选，但如果阴性，则应使用FISH或RNA水平融合检测的附加检测。在肉瘤中，由于其特异性较低，应避免免疫组化。值得注意的是，越来越多的综合融合检测已作为肉瘤的一线检测，而不是像在癌症中那样等待基于DNA的分类的结果。因此，建议将NTRK引物包括在全面的肉瘤融合检测面板中。在NTRK的检测前可能性低的癌症中融合，例如大多数癌症，神经胶质瘤和黑色素瘤，经常进行分子检测，例如基于DNA的癌症基因检测，可以使用驱动程序状态来缩小应作进一步致癌融合筛选的肿瘤范围，例如NTRK融合通常与激活MAPK信号传导的其他常见促有丝分裂驱动器改变互斥。因此，所得的“驱动程序阴性”病例可能富含NTRK融合蛋白，可以通过IHC或基于RNA的融合检测法进行筛选。对于肺癌和大肠癌，重点介绍如何在无法进行常规常规筛查的环境中进一步丰富NTRK融合蛋白。
　　 通常带有NTRK融合的罕见癌症亚型包括乳腺和唾液腺的分泌性癌，婴儿纤维肉瘤，先天性中胚层肾癌和小儿甲状腺乳头状癌。对于这些肿瘤，首选基于组织学的测试算法，并且应使用具有高特异性的首选方法对NTRK融合进行确认。如果通过单一方法阴性，则应进行其他测试。第二组包括许多类型的癌症，其携带NTRK融合的可能性很小。这些低概率癌症包括肺癌，乳腺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，胆管癌，成年甲状腺乳头状癌，黑素瘤，神经胶质瘤和肉瘤。质量筛选方法包括使用广泛的NGS进行全面的分子评估，其中包括对NTRK的评估如上所述，将其作为整体的一部分进行融合，或通过免疫组织化学进行常规筛选，并具有上述警告和限制。基于大规模筛选的检测不是算法，也不涉及分类。它是指通过免疫组织化学或全面的基于DNA和RNA的检测方法测试所有患者。因此，如果仅筛查患病率极低的变异，则本质上效率低下。
　　 在许多情况下，组的癌症类型与窝藏的概率低NTRK融合，可以类选肿瘤更可能怀有NTRK基于其基因组谱的融合体。因此，排除已经鉴定出已知促有丝分裂驱动因子的病例，可以显着缩小要系统筛选NTRK融合的病例数目。例如，在研究中，驾驶员阴性的肺腺癌中观察到可靶向激酶融合的RNA测序的产率很高，该突变也显示出较低的肿瘤突变负担。在另一项类似的研究中，用MSK-IMPACT检查2314例结直肠腺癌队列，确定21例激酶融合病例，其中8例NTRK融合。在21例激酶融合病例中，大多数存在于微卫星不稳定性病例中。在这24例大肠癌病例中，由于MLH1启动子甲基化而表现出微卫星不稳定性，并且在RAS或BRAF中没有驱动突变，其中10例具有激酶融合，其中6例具有NTRK融合。总体而言，这项研究的发现确定应该高度怀疑激酶融合的大肠癌子集。因此，将辅助测试的重点放在具有微卫星不稳定性且缺乏其他常规驱动突变的结肠腺癌上可能是最有效的。对于肺癌和大肠癌，这种方法强调了如何在无法进行常规常规筛查的环境中进一步丰富NTRK融合蛋白。出国看病网研究人员不建议对驾驶员阴性的肺或大肠癌病例的这些子集进行进一步的检查，而主要希望强调应该对哪些类型的病例进行进一步筛查具有最高优先级。
　　 致癌性NTRK基因融合发生在许多不同的肿瘤类型中。尽管它们存在于某些罕见肿瘤的大多数中，但它们也很少出现在许多常见的癌症中。随着最近FDA对NTRK靶向疗法的批准以及这些药物在NTRK融合阳性癌症患者中产生的显着和持久的反应，鉴定具有这些融合物的肿瘤变得至关重要。方法与ESMO转化研究和精密医学工作组最近发表的建议相呼应，但更加重视基于基因组的分类。在癌症治疗时间表的更下游，因为更常规地检测NTRK融合，使患者享有TRK抑制剂，出国看病网研究人员也必须考虑分子诊断测试如何检测获得性耐药的机制在这些患者中，无论在目标第二位点突变NTRK激酶结构域，并激活变化旁路信号通路。