导治疗胶质母细胞瘤中替莫唑胺耐药 |
胶质母细胞瘤是成人中最常被诊断的原发性脑恶性肿瘤之一,即使采用积极的多模式疗法,其预后也很差,其5年生存率低于5%。目前GBM的综合治疗策略包括最大程度的手术切除,放疗和替莫唑胺化疗。TMZ通过使鸟嘌呤残基上的N-7或O-6烷基化来减弱GBM的生长,从而改善GBM患者的整体生存。但是,大多数患者仍会在7个月内复发肿瘤。逐渐获得的GBM的TMZ耐药性导致肿瘤进展和复发,因此在很大程度上限制了TMZ对GBM患者的益处。GBM细胞主要通过O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶依赖性DNA修复获得对TMZ的抗性,而MGMT的缺失会导致错配修复和随后的DNA双链断裂。研究已经证明,多个分子有助于获得TMZ的阻力。要确定复发性GBM新的潜在的化学疗法的目标,还需要进一步研究TMZ抗性机制。
越来越多的数据表明,激酶是癌症多种生物学行为的功能必需,表明激酶可能成为癌症的新型治疗靶标。AXL受体酪氨酸激酶对于广泛的生物学功能至关重要,包括GBM中的增殖,有丝分裂,迁移,侵袭和抗炎。AXL已被鉴定为具有位于纤连蛋白III型结构域的两个免疫球蛋白样结构域的细胞外激酶。AXL富含GBM肿瘤坏死区域周围的假性神经胶质瘤细胞,而AXL的功能破坏可降低小鼠模型中神经胶质瘤细胞的生长和迁移。AXL的表达可能与间充质神经胶质瘤干细胞有关,后者被认为是对GBM更具治疗抵抗力的亚型,预示着GBM患者的预后较差,15为GBM的未来治疗发展提供了有力的证据。本文中分析了耐TMZ的GBM细胞系的转录组谱,以鉴定AXL为GBM中潜在的药物激酶。此外,在耐TMZ的GBM细胞中AXL表达显着增加,外源性抑制AXL导致GBM中的细胞生长和TMZ耐药性减弱。AXL抑制剂和TMZ的组合在体外和体内均显着降低了耐TMZ的GBM细胞的增殖和肿瘤发生,这表明具有协同作用。总之,AXL是TMZ敏感性和GBM患者预后的重要生物分子预测指标,并且可能成为化疗耐药性GBM的新潜在治疗靶标。
为了探索神经胶质瘤中获得的TMZ耐药性的关键调控因子和分子机制,使用先前发布的GEO数据库进行了分级双聚类。1在668个已知的激酶编码基因中,与单纯的对照细胞相比,AXL是TMZ耐药性GBM细胞中最高级的激酶编码基因之一,表明AXL对于神经胶质瘤的发生可能至关重要。获得TMZ电阻。AXL明显丰富了GBM,GBM被认为是最致命的神经胶质瘤类型。基于表观遗传特征,GBM细胞可分为几种亚型,这些表观遗传特征与完全不同的生物学行为相关,包括肿瘤增殖,复发和治疗耐药性。比较了不同GBM亚型之间的AXL表达。结果表明,AXL表达明显富集于间充质亚型,这被认为对治疗更具抵抗力,并导致肿瘤复发。增生性血管区域和微血管增生区域可观察到AXL表达增加,这与肿瘤复发相关在GBM中。最后,使用5个GBM品系进行蛋白质印迹,而将NHA用作非肿瘤对照。结果显示,与NHA细胞相比,GBM细胞中AXL表达显着增加。总之,这些结果表明GBM中AXL升高,可能对治疗耐药性和肿瘤复发至关重要。
这些结果表明AXL可能是GBM的生物标记。为了评估这种可能性,从TCGA数据库中对所有514名可用的神经胶质瘤患者进行了总生存期分析。与AXL表达较高的患者相比,AXL表达较低的患者的术后生存期显着延长。通过分析伦勃朗数据库来评估GBM中AXL的表达。与低度神经胶质瘤相比,GBM中的AXL明显增加。IHC在2008年至2017年从医院神经外科的外科手术切除患者收集的68例胶质瘤肿瘤组织中进行了AXL表达检测。AXL被发现于细胞质以及细胞膜的肿瘤细胞。GIS评分显示,与低级神经胶质瘤样本相比,AXL在GBM中明显富集。关于患者的存活,与神经胶质瘤表达高水平的AXL的患者相比,AXL表达低的神经胶质瘤的患者具有更长的总生存期。当专门针对GBM患者时,获得了类似的结果。结果表明AXL可能是GBM的特定临床相关激酶。
为了彻底研究AXL在GBM中获得性抗TMZ的功能中的作用,根据以前的出版物建立了U87和U251的TMZ抗性体外培养物。与含有TMZ的培养基3个月培养后,U87和U251细胞与它们的天然对照。使用耐TMZ的GBM细胞系进行qRT-PCR分析,结果表明U87和U251细胞的耐TMZ的群体中AXL表达显着增加。此外,蛋白质印迹结果还显示在耐TMZ的U87和U251细胞中AXL和AXL磷酸上调。为了进一步评估AXL在GBM中的功能,用2个AXL慢病毒shRNA克隆或非靶向对照慢病毒转导了GBM细胞系U87和U251。qRT-PCR和蛋白质印迹分析均显示在mRNA水平上AXL显着下调。为评估AXL对TMZ耐药的功能,先用shNT或shAXL慢病毒转导U87TMZ耐药细胞,然后以300uM的TMZ处理。用shAXL慢病毒转导后,U87TMZ耐药细胞中的体外细胞生长试验显示出细胞增殖减少和TMZ敏感性增强。流式细胞仪检测凋亡的方法是使用经shAXL或shNT预转导的U87TMZ耐药细胞。细胞经历或者早期凋亡或晚期凋亡显着增加时的细胞与那些仅接受TMZ。使用颅内异种移植小鼠模型研究了ALX敲低对体内肿瘤发生的功能。与经shAXL转导的U87TMZ耐药细胞联合TMZ处理的小鼠相比,shNT转导的U87TMZ耐药细胞异种移植的小鼠迅速出现肿瘤相关症状,GBM细胞中AXL沉默的anti-TMZ抗性作用。为了阐明依赖AXL的TMZ的分子机制,在U87GBM细胞中通过慢病毒感染进行了AXL的人工过表达。qRT-PCR和蛋白质印迹分析证实,AXL过表达的U87细胞中AXL和磷酸化AXL均显着增加。体外细胞生长试验表明,外源性AXL过表达后TMZ抵抗力明显增加。用TMZ处理具有或不具有ALX过表达的U87细胞,并分析细胞凋亡。AXL过表达后TMZ抗性增强,表明AXL有助于GBM中获得性TMZ抗性。
AXL被确定为GBM中获得性TMZ抵抗的必要调节剂。因此为表征AXL抑制剂在GBM治疗中的功效,研究中将TP‐0903用作特定的AXL抑制剂。首先发现U87TMZ耐药细胞对TP-0090表现出相同的反应,这表明AXL抑制剂对于TMZ耐药GBM仍然有效。此外,体外增殖试验表明TP‐0903减弱了TMZ耐药性U87细胞的生长,更重要的是,TP‐0903大大逆转了获得的TMZ耐药性。流式细胞仪显示TP‐0903处理可增加细胞凋亡比例并增强TMZ对U87TMZ耐药细胞的细胞毒性。研究TP‐0903对体内肿瘤发生的作用。使用颅内异种移植小鼠模型,TMZ和TP‐0903的治疗在植入U87TMZ耐药细胞后第7天开始,并通过尾静脉注射持续10天。不出所料,单独用TMZ治疗小鼠时,肿瘤生长的抑制作用非常有限。当TMZ与TP-0903结合使用时,可观察到肿瘤生长明显减少和存活时间延长。AXL抑制剂和TMZ的组合减弱了TMZ耐药性GBM细胞的肿瘤增殖和致瘤作用。为了进一步阐明AXL抑制作用是通过与TMZ的累加作用还是协同作用降低肿瘤的生长和对TMZ的抵抗力,使用了Chou-Talalay方法。用TMZ,TP-0903或这两种药物的不同剂量处理了U87耐TMZ细胞,并在第3天测量了对细胞生长的抑制作用。数据表明,TMZ的结合指数TP-0903<1,表明AXL抑制与TMZ处理对TMZ耐药性U87细胞具有协同作用。
越来越多的证据表明,激酶依赖性激活的对放射疗法和化学疗法的耐药性对于GBM的复发和致死性至关重要。已知的激酶编码基因,AXL已经证明是负责各种生物学行为,如细胞增殖,侵入和肿瘤增殖,在广泛范围的人类恶性癌症,如乳腺癌,胰腺癌的,卵巢癌和肺癌等AXL属于TAM,该激酶结构域内共享的结构同源性的受体酪氨酸激酶的亚家族。在GBM中可以观察到AXL表达异常升高。抑制AXL降低了GBM细胞增殖和肿瘤迁移。AXL基因敲除已显示出对间充质GBM更有效的抑制,已被证明是更恶性和更耐放射的亚型。AXL的临床相关性已在以前的大量研究中进行了研究。AXL表达增加会导致神经胶质瘤的不良预后,这已被证明对现有疗法具有更高的抵抗力。此外单纯的GBM细胞相比,TMZ耐药性GBM细胞中AXL表达升高,并且与GBM中的TMZ耐药性密切相关。通过慢病毒转染或抑制剂抑制AXL会导致体内外GBM细胞的肿瘤发生减少和TMZ耐药性降低,这表明AXL可能是GBM的临床治疗靶标。此外,TMZ抑制剂TP-0903通过与TMZ的协同作用显着降低了肿瘤的生长。AXL促进了GBM中对TMZ的肿瘤发生和化学耐药,并且可以用作GBM患者的预后生物标志物。可以开发AXL抑制剂以使GBM细胞对TMZ敏感并改善GBM患者的生存率。为此,应该设计和产生一种新的具有更高功效和更少副作用的AXL抑制剂,并且将来应该进行临床试验,尤其是多中心临床随机对照试验。
AXL主要通过AXL激酶功能域内的Tyr779和Tyr691磷酸化而起癌基因的作用。磷酸化的AXL富含GBM肿瘤的特征区域,例如细胞过度区,假栅状区域和血管增生。通过分析常春藤神经胶质瘤数据库,与肿瘤的其他区域相比,增生性血管和微血管增生区域的AXL表达增加。由于GBM的肿瘤发生和侵袭高度依赖于这些特定区域,这些结果提高了基于磷酸化的AXL活化对于GBM中获得的对TMZ的化学耐药性必不可少的可能性。但是,分子机制仍需进一步研究。此外,这项研究没有明确阐明AXL的激活机制和潜在的分子信号传导。今后应设计和进行进一步研究,以研究AXL对GBMTMZ抗性的转录调控和磷酸化机制。
总之,海外医疗网研究人员通过全基因组分析表明,AXL是耐TMZ的GBM细胞中激酶编码最高的基因之一。AXL表达升高表明GBM患者的预后较差。此外,AXL组合物在体外和体内均可减少U87TMZ耐药细胞的肿瘤发生和化学耐药性;外源性AXL过表达诱导了GBM中的TMZ抗性。最后,一种特异的AXL抑制剂TP-0903通过协同作用显着降低了肿瘤的生长并提高了对TMZ的敏感性。AXL有助于获得GBM中的TMZ耐药性,并且可以用作GBM的新的预后因素和治疗靶标。AXL促进了GBM中的肿瘤发生以及获得的TMZ耐药性,并可能成为GBM的新型预后生物标志物和治疗靶标。
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