胶质瘤约占脑肿瘤的50％，其特征是恶性程度高，发病率高和死亡率高。目前的神经胶质瘤标准治疗方法包括最大程度的手术切除，然后进行放疗和化疗。几乎所有患者均接受替莫唑胺治疗，大多数患者发生肿瘤复发和化学耐药性，导致预后较差，中位生存期仅为14个月。因此，关键是要找出神经胶质瘤发生的调节剂，并开发出有效的治疗方法来治疗神经胶质瘤。二氢叶酸还原酶和胸苷酸合成酶是叶酸信号传导途径中的关键代谢酶。TYMS可以触发从头嘧啶生物合成途径的脱氧尿苷酸到脱氧胸苷的转化，而DHFR会增加由二氢叶酸生成的四氢叶酸。活性叶酸来源于四氢呋喃。DHFR的异常表达可能导致肿瘤细胞产生化学耐药性。例如，DHFR的过度表达增加了卵巢癌中顺铂耐药细胞的表达。TYMS表达水平的升高是5-氟尿嘧啶耐药的主要机制之一，可能是胃癌和大肠癌的重要预后因素。培美曲塞是DHFR和TYMS的抑制剂，已经被FDA批准用于恶性胸膜间皮瘤的一线治疗和晚期非小细胞肺癌的二线治疗，因此，DHFR是几种类型癌症的有希望的治疗靶点。但是，没有直接的证据显示DHFR与神经胶质瘤的发生之间存在相关性。因此，探索DHFR在神经胶质瘤生长中的作用可能揭示新的生物学功能，并为神经胶质瘤治疗提供新的治疗机会。
　　 TMZ是神经胶质瘤治疗的主要化学治疗剂。TMZ诱导的细胞死亡的典型途径是O-6-甲基鸟嘌呤的形成和由O-6-甲基G：T错配对触发的凋亡信号传导。为了提高TMZ的敏感性，已经开发出了不同的治疗分子。但是，靶向神经胶质瘤的化合物必须有效地穿过血脑屏障，这很难实现。目前对TMZ耐药的神经胶质瘤仍然无法治愈，需要改进治疗策略。最近TMZ对神经胶质瘤的细胞毒性机制参与了AMPK的活化，进一步抑制了mTORcomplex1信号传导并促进了TMZ诱导的细胞凋亡作用。考虑到DHFR抑制剂培美曲塞也可以激活肿瘤细胞中的AMPK，出国看病网研究人员假设DHFR的抑制作用可能会通过AMPK-mTOR信号通路调节胶质瘤细胞对TMZ的细胞敏感性。在这项研究中表明DHFR在人类神经胶质瘤组织和细胞中高表达，并促进神经胶质瘤细胞的增殖。siRNA或PTX对DHFR的抑制作用增加了胶质瘤细胞对TMZ的敏感性，这是通过激活AMPK并因此抑制了mTOR信号通路。这些发现确定了DHFR在神经胶质瘤进展中的关键作用以及神经胶质瘤细胞对AMPK-mTOR信号介导的TMZ的敏感性。因此，DHFR可用作神经胶质瘤治疗的有希望的治疗靶标。
　　 从医学院神经外科采集了1个人类肿瘤邻近组织和9个神经胶质瘤组织。神经病理学家根据世界卫生组织的标准对所有组织样品进行分级，并储存在液氮中。对照来自正常脑组织。9名患者的神经胶质瘤标本用G1-G9标记，包括Ⅰ级，Ⅱ级，Ⅲ级和Ⅳ级。来自9名患者的神经胶质瘤标本包括5名男性和4名女性。人类神经胶质瘤细胞系U87，U251获自生物化学与细胞生物学研究所，保持完整的RPMI-1640。所有培养基均补充有10％的胎牛血清和百分之一　的青霉素-链霉素。所有细胞均在37摄氏度下于5％CO的培养箱中培养气氛。细胞活力通过磺胺丁丹B测定来测量。在96孔板中培养3–5×10细胞。24小时后将细胞用质粒或siRNA转染或用所示化合物处理，并在所示时间测量细胞活力。通过自动图像分析评估细胞数。1×10细胞在6孔板中培养。24小时后将细胞用DHFRsiRNA或加扰对照转染48小时，并在指定时间测量细胞增殖。为了检测细胞凋亡，将细胞暴露于指定的化合物，并在孵育48小时后收集。然后将收集的细胞用PBS洗涤，重悬于冷结合缓冲液中，并根据BectonDickinson的制造商规程，用5ulAnnexinV-PE和5ulPI染色15分钟。将叶酸以200ug每毫升的浓度溶于1640。将替莫唑胺溶解在DMSO中，浓度为50毫米。将培美曲塞溶解在0.9％NaCl溶液中，浓度为10毫米。将PTX溶解在盐溶液中，将TMZ溶解在含10％DMSO的盐溶液中。对于小鼠，腹膜内给予相应的媒介物和PTX，通过口腔管饲法施用TMZ和媒介物，并注射量根据体重确定。
　　 脑胶质瘤组织被包埋在石蜡中。对于免疫组化，将切片用二甲苯脱蜡，并在一系列梯度的乙醇中再水化，内源过氧化物酶被3％H2O2阻断。一抗在4摄氏度下孵育过夜。一抗如下：DHFR，TYMS，Ki67，BrdU。使用适当的二抗进行检测。特别是，将切片去石蜡，然后用苏木精和曙红进行染色，将细胞接种到培养玻片上，用4％多聚甲醛固定并用透化。封锁后将细胞与第一抗体和第二抗体一起温育。通过用DAPI染色使细胞核可视化。用ZeissLSM510Meta荧光共聚焦显微镜或LeicaDM2500显微镜采集图像。对于叶酸补充和缺乏模型，给裸鼠喂食不同的叶酸补充饮食4周。然后通过向每只裸鼠的腋窝中接种4×106个细胞每0.1毫升盐溶液来建立神经胶质瘤U251异种移植物。4周后，收集肿瘤组织并通过蛋白质印迹检测DHFR的表达。所有动物研究均按照浙江大学药物安全性评价研究中心IACUC的规定进行。终止标准是肿瘤重量增长超过体重的10％或总体健康状况总体恶化。为了检查神经胶质瘤中的DHFR表达，在不同类型的肿瘤细胞中进行了免疫印迹。与其他体细胞瘤细胞相比，DHFR的表达在神经胶质瘤中更富集。此外，分析了一种具有不同恶性程度的正常脑组织和九种神经胶质瘤组织。DHFR胶质瘤组织中的mRNA水平在正常脑组织，该产物与蛋白表达。为了进一步表征DHFR的表达模式，通过免疫组织化学分析了来自人类患者的总共17个神经胶质瘤组织。一个正常组织和两个具有不同DHFR表达水平的代表性神经胶质瘤病例，这与TCGA数据库一致，即神经胶质瘤组织显示的DHFR比正常组织更大的上调。此外，对染色强度进行评分并分类为阴性，低，中等阳性细胞）和高阳性，所有样品中DHFR的对应模式显示，在17例脑胶质瘤病例中，只有1例被归类为DHFR阴性表达12％）。肿瘤组织，而其他16个样本显示中等至加重的DHFR88％）免疫反应性。总的来说，这些数据表明DHFR在神经胶质瘤细胞和组织中的独特高表达。
　　 由于DHFR富含神经胶质瘤，接下来评估DHFR对神经胶质瘤增殖的影响。用pCMV6-DHFR质粒转染U87和U251神经胶质瘤细胞，并测量细胞活力。无论是DHFR或TYMS的过表达促进了U87和U251细胞的增殖，并且两个DHFR和TYMS协同增强细胞增殖的共同过表达。相反，通过siRNA敲低DHFR会显着减少细胞数，表明它们在神经胶质瘤细胞增殖中起关键作用。为了进一步研究DHFR敲低是否会影响细胞凋亡，进行Annexin染色，共转染U251细胞相比，siRNA沉默DHFR可以增加U251细胞凋亡的百分比。DHFR和TYMSsiRNA特别将凋亡百分比从6.42％提高到28.23％。因此，这些结果表明DHFR可以促进神经胶质瘤细胞的增殖，而DHFR的丧失则降低了细胞的增殖速率并增加了凋亡的神经胶质瘤细胞。考虑到DHFR是典型的叶酸途径基因，在某些肿瘤细胞中参与嘧啶的合成，接下来询问叶酸激活DHFR是否还会影响神经胶质瘤的增殖。类似于基于质粒的DHFR过表达，FA以浓度依赖的方式激活U251和U87细胞中DHFR和TYMS的表达，并显着增加了相应的活细胞数。与对照组相比，在FA处理组中，通过BrdU脉冲标记实验揭示的细胞增殖速率似乎有所提高。为了进一步证实DHFR对体内神经胶质瘤增殖的影响，出国看病网研究人员采用了先前研究改良的叶酸补充小鼠模型。将裸鼠分为正常FA补充饮食组，低FA补充饮食组和高FA补充饮食组。在将U251肿瘤细胞植入裸鼠的腋窝之前，先通过补充FA的饮食对裸鼠进行治疗4周。重要的是发现高FA补充剂显着增加了平均肿瘤体积，而低FA补充剂则显着抑制了肿瘤生长。这项动物研究结束时，蛋白质印迹证实，高脂肪酸饮食能有效激活DHFR的表达，而低脂肪酸饮食不足会降低DHFR的表达。此外，组织学分析显示，Ki67增殖细胞与FA剂量呈正相关。这些数据表明FA对DHFR的激活促进了神经胶质瘤细胞的增殖。
　　 口服烷基化剂替莫唑胺是神经胶质瘤治疗中的标准化学疗法。要研究与TMZ联合使用对神经胶质瘤细胞的阻断DHFR途径是否具有协同的抗肿瘤作用。用DHFRsiRNA和TMZ单独或组合处理U87和U251细胞。存活分数分析表明，在测试浓度下的TMZ和siDHFR表现出有限的细胞毒性，而siDHFR和TMZ的组合与单独使用时相比显着降低了细胞活力。培美曲塞是DHFR和TYMS的抑制剂，也显示了与TMZ的协同抗肿瘤作用。此外，细胞形态学检查显示，PTX和TMZ处理导致坏死的形态学变化和活细胞百分比降低。此外，Annexin染色显示PTX极大地增加了TMZ诱导的凋亡率。联合治疗导致神经胶质瘤细胞中裂解的caspase-3和裂解的PARP的凋亡蛋白水平显着增加。
　　 此外，为了表征PTX和TMZ组合诱导的增加的抗肿瘤作用，出国看病网研究人员建立了U251异种移植神经胶质瘤小鼠模型。在将细胞植入裸鼠之后，在给药之前允许肿瘤达到80毫米3的平均肿瘤体积。然后每隔一天以50mg每公斤注射PTX剂量为50mg每公斤，连续15天。与PTX或TMZ作为单一疗法相比，PTX和TMZ的联合治疗产生了显着的抗肿瘤作用。PTX加TMZ表现出对肿瘤生长的抑制，TGI值为76％，而PTX治疗组和TMZ治疗组的TGI值分别为50％和47％。
　　 TMZ可能导致AMPK活化并随后抑制癌细胞系中的mTOR信号通路，这表明AMPK-mTOR信号通路可能参与TMZ结合DHFR抑制的增强抗肿瘤作用。因此，分别用TMZ和DHFR抑制剂PTX处理U251和U87细胞48小时，然后通过检测肌动蛋白的表达水平。通过同时用PTX和TMZ处理，AMPK的表达显着上调。此外，在PTX和TMZ的联合治疗中，mTOR，p70S6K和4E-BP1的磷酸化减少证明了AMPK的激活增加导致mTOR失活。根据以上结果，鼓励研究AMPKa的特异性抑制是否能够逆转PTX和TMZ诱导的细胞凋亡。用转染U251细胞，并用PTX和TMZ处理。与对照组相比，shAPMKa1＃中的AMPKa表达降低导致凋亡细胞百分比降低，在shAMPKa2＃中结果相似。TMZ对神经胶质瘤细胞的DHFR抑制诱导的协同凋亡作用应由AMPK激活和随后的mTOR信号传导抑制介导。
　　 快速发生率和不良预后是恶性神经胶质瘤的最常见特征，导致没有有效的治疗方法。然而，神经胶质瘤发生的机制是复杂的，尚未完全定义。DHFR和TYMS是叶酸信号通路中的关键酶，已知在中枢神经系统的发展中起着重要的作用。DHFR和TYMS在神经胶质瘤组织和细胞中独特富集，并促进细胞增殖，进一步证明了DHFR的抑制是通过激活AMPK和抑制mTOR信号通路来抑制胶质瘤细胞对TMZ的。DNA合成需要DHFR，DNA合成在细胞增殖中起着至关重要的作用。最近，在肉瘤，急性淋巴细胞白血病，卵巢癌，胃癌中报道了DHFR和TYMS的功能和大肠癌，表明它可能是神经胶质瘤的分子驱动因子。在神经胶质瘤细胞中观察到的DHFR表达甚至高于其他选定的肿瘤细胞。尽管仅使用了两种神经胶质瘤细胞系，但还检测到与正常脑组织相比，DHFR的表达在17种临床神经胶质瘤组织中富集，这与TCGA数据库一致。这些结果表明，DHFR可能在神经胶质瘤的生长中起关键作用。叶酸信号通路在肿瘤中的作用仍存在争议。一方面，叶酸补充剂可促进乳腺癌的恶化，叶酸缺乏会降低神经管细胞癌的发生率。另一方面，荟萃分析显示患者血液中叶酸水平与宫颈癌的发生率呈负相关。补充叶酸可降低结直肠癌的风险。证明通过质粒转染或叶酸处理过表达DHFR可以加速神经胶质瘤细胞的生长。通过siRNA敲低DHFR可以显着抑制神经胶质瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。总之，出国看病网研究人员的研究结果表明DHFR是致瘤潜力中的重要调节剂，并且可以作为神经胶质瘤新疗法开发的目标。
　　 TMZ可以通过诱导O6MeG用作胶质瘤的典型药物。但是，频繁的耐药性和快速复发限制了其应用。因此，提高TMZ敏感性的测试策略将有助于临床化疗。一些基因与TMZ抗性有关，例如甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶，信号转导子和转录激活子3。PARP抑制剂CEP-8983或ABT-888在体内和体外均可协同增强TMZ的抗肿瘤作用。在这里发现siDHFR和TMZ的组合通过增强caspase介导的细胞凋亡发挥了对抗人神经胶质瘤的协同作用。此外，该功能在神经胶质瘤U251异种移植模型中得到验证。值得注意的是，与TMZ结合使用PTX对DHFR进行药物抑制可协同抑制神经胶质瘤的增殖并诱导细胞凋亡。TGI显着高于用作单一疗法的任何一种化合物。
　　 除了由TMZ诱导O6MeG之外，TMZ激活AMPK磷酸化，然后抑制mTOR和下游因子的表达，从而导致神经胶质瘤细胞凋亡。因此，抑制DHFR和TMZ的协同作用可能是由于AMPK激活所致。不出所料，出国看病网研究人员的数据表明，siRNA和PTX抑制DHFR可以增强TMZ对AMPK的激活，并随后抑制mTOR信号通路。值得注意的是，神经胶质瘤细胞中转染对AMPK的抑制作用导致协同作用减弱，如凋亡率降低所表明。出国看病网研究人员的观察结果强烈表明，通过抑制AMPK-mTOR信号传导，抑制DHFR可以使TMZ协同作用于神经胶质瘤，并且是提高脑胶质瘤患者TMZ疗效的可行策略。总之，出国看病网研究人员首次证明DHFR在神经胶质瘤进展和TMZ敏感性中起关键作用。DHFR沉默激活AMPK磷酸化，这有助于TMZ在神经胶质瘤中的抗癌作用。总体而言，DHFR抑制剂的组合所观察到的优异药理作用为解决TMZ耐药性和阐明神经胶质瘤治疗途径提供了必不可少的步骤。