弥漫性神经胶质瘤IDH突变检测 |
2016年世界卫生组织对中枢神经系统肿瘤的分类将弥散性胶质瘤细分为异柠檬酸脱氢酶1和2基因和1p /19q密码子的突变状态。IDH突变状态被用作与其他疾病实体的鉴别诊断的分类器,并且其预后价值优于组织学等级。实际上,IDH -mutated所有组织学分级的漫胶质瘤具有更好的预后,而低等级IDH野生型神经胶质瘤似乎具有侵略性的临床行为,可能需要与胶质母细胞瘤相似的辅助治疗。约95%的IDH1突变体漫胶质瘤具有在IDH1基因突变在残基R132,而剩余的5%的显示IDH2突变在R172残基。值得注意的是,R132H突变占所有IDH1突变的90%,可以使用特定抗体通过免疫组织化学检测到,而DNA测序则需要鉴定其他IDH1或IDH2突变。
在少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤中均发现IDH突变。OD定义为根据WHO 2016分类始终具有IDH突变和1p / 19q染色体密码缺失的肿瘤。相反,具有星形细胞瘤IDH突变通常显示α地中海贫血/精神发育迟缓综合征X连锁蛋白的表达,由此产生的损耗,从而灭活基因的突变。据报道ATRX丢失与1p / 19q缺失互斥,因此,作为区分星形胶质细胞和少突胶质细胞瘤的有用标记。
弥漫性胶质瘤中IDH突变的发生与患者的年龄密切相关,据报道,大于等于55岁的患者中IDH突变的发生率非常低。因此在这个时代提高成本意识的,曾有人质疑是否对IDH1 R132H或DNA测序的其他免疫IDH1或IDH2突变应在55岁以上的患者都弥漫胶质瘤进行。由于非常低发病率与非规范性GBM的IDH大于等于55岁的患者存在突变,WHO建议针对IDH1 R132H的免疫组织化学足以将这些肿瘤归类为IDH野生型。但是,没有提供II级和III级星形细胞瘤需要IDH突变测试的迹象。在这项研究中,旨在阐明仅免疫组织化学是否足以将低度弥漫性胶质瘤分类为IDH野生型,并且其特征与IDH相关大于等于55岁的患者发生突变。为了解决这个问题,出国看病网服务机构测试了273例弥散性神经胶质瘤的IDH1 R132H免疫组织化学,并在免疫阴性低级病例中进行了DNA测序。然后,在癌症基因组图谱数据库中考虑了大于等于55岁的患者中的311例弥漫性神经胶质瘤,从而验证了发现。
该研究得到当地伦理委员会的批准,并根据1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修正案中规定的伦理标准进行。收集了2014年1月至2018年10月在意大利维罗纳大学医院手术的,年龄大于等于55岁的成年患者的273例经组织学诊断。所有病例均经过福尔马林固定和石蜡包埋以进行常规组织学评估。手术标本已完全接受了组织病理学分析。除17例外,其余均位于半球位置,有44例患者接受了活检。在中线位置的所有病例中均可获得H3 K27M免疫组织化学数据。术前对神经影像学检查以确认组织学类型和等级。回顾手术报告和术后神经影像检查以确定IDH的切除范围突变型和IDH野生型神经胶质瘤。根据组织学类型,组织学等级,年龄和O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶启动子的甲基化状态,患者接受不同的手术后治疗。212名患者的术前卡诺夫斯基表现状态得分大于等于70。机构的所有病例均使用针对IDH1 R132H,p53和ATRX的抗体免疫染色1:750;生命科学Sigma-Aldrich,通过自动免疫染色仪。按照先前的建议对p53免疫染色的玻片进行评估和评分。
在来自机构的ATRX保留和IDH突变的病例中,FISH检测了1p / 19q密码缺失的存在。详细按照制造商建议的方案,使用LSI 1p36 / 19q13双色探针组处理样品。通过配备100×油浸物镜和三带通滤光镜的Olympus BX61荧光显微镜检查玻片。计数了至少包含两个参考探针信号的200个非重叠核。1p / 1q和19q / 19p之比是通过将橙色和绿色信号的数量相除而得出的。使用10个连续的4um切片进行手动显微解剖,将肿瘤细胞富集至至少70%后,从FFPE组织中制备肿瘤DNA。使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒纯化DNA,并按照其他地方的方法进行鉴定。13简而言之,IDH1和IDH2通过聚合酶链反应扩增DNA,并使用ABI PRISM 3500遗传分析仪对两条链进行测序。PCR条件是:在95℃变性5分钟;在95°C / 30s,58°C / 30s和72°C / 30s下进行40个循环; 在72℃/ 5分钟的伸长步骤。
在所有案例中,都评估了O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶启动子的甲基化状态。简而言之,使用EpiTect Plus FFPE亚硫酸氢盐试剂盒中包含的硫酸氢钠孵育200 ng DNA,并通过MGMT Plus试剂盒使用焦磷酸测序进行分析。该测定法对位于hr10上的10个CpG岛中每个岛的甲基化百分比进行了定量分析。根据与临床结果相关的甲基化状态的扩展,将样品分为四组:未甲基化,低水平;未甲基化。中级;高水平。出国看病网服务机构只考虑了55岁以上且IDH1 / IDH2突变的弥漫性神经胶质瘤。收集IDH突变或IDH野生型神经胶质瘤患者总体生存率的数据。TGCA队列中有310例患者的总体生存率和患者状态信息。卡方检验用于评估各组之间的统计学差异。
计算敏感性和特异性用于星形细胞肿瘤。对数秩检验用于研究IDH突变型和IDH野生型肿瘤或术前KPS评分是否存在生存期差异。多变量分析用于确定每个变量的独立作用。小于0.05的概率值被认为是重要的。使用MedCalc 12.1.4.0统计软件进行统计分析。2014年1月至2018年10月间,在出国看病网服务机构机构共发现了273例经组织学诊断的大于等于55岁的弥漫性胶质瘤。星形细胞瘤,七个间变性星形细胞瘤,256个胶质母细胞瘤,两个OD和两个间变性少突胶质细胞瘤。
术前神经影像学修订后,两个DA被重新解释为AA。因此队列最终由四个DA,九个AA,256个GBM,两个OD,两个AO组成。273例病例中有12例的IDH1 R132H染色阳性。所述IDH突变例8星形细胞肿瘤和4/4少突胶质细胞瘤。沿中线结构定位的病例均未进行IDH1 R132H或H3 K27M免疫染色。在IDH1免疫阴性病例中,所有LGG和25个GBM都接受了DNA测序,所有结果均为IDH野生型。在IDH突变型神经胶质瘤中,所有四种少突胶质细胞瘤均保留ATRX免疫组化表达,并且p53染色阴性。ATRX表达在四个星形细胞肿瘤中丢失,并在四个中保留。在1/2 DA,4/4 AAs和2/2 GBM中,超过40%的癌细胞中p53免疫染色呈阳性,而在一个DA中,p53免疫染色呈阴性。在队列中,MGMT启动子在一个IDH突变体和21个IDH野生型星形细胞瘤中未甲基化或甲基化水平低,而在11个IDH突变体和11个IDH野生型星形细胞瘤中处于中等或高甲基化水平。
在TGCA队列中发现大于等于55岁的311例弥漫性神经胶质瘤包括16个DA,48个AA ,211GBM,15OD和21AO。311例病例中有57例是IDH突变的,包括21例星形胶质细胞和36例少突胶质肿瘤 ,21个AO)。除一个DA和一个AO外,所有肿瘤均具有IDH1 R132H突变。IDH野生型为254/311例。除了两个少突胶质细胞瘤以外,所有肿瘤均无ATRX突变,无TP53突变。在21个IDH突变星形细胞瘤中,有4/10个DA,3/8个AA和1/3个GBM没有ATRX突变。2个DA和1个AA没有TP53突变,它们也是ATRX野生型。在具有非常规IDH突变的病例中,一个是具有IDH2 R132G突变且没有ATRX和TP53突变的AO 。另一个是DA,在没有ATRX的情况下具有IDH1 R132C突变,TP53突变。MGMT启动子甲基化存在于56个IDH突变体和88个IDH野生型病例中。1例IDH突变体和130 例IDH野生型病例未甲基化对星形细胞瘤的敏感性为86%,特异性为100%。结合的ATRX突变/无染色和TP53突变/ p53染色对星形细胞肿瘤具有90%的敏感性和100%的特异性。生存分析仅包括IDH突变型神经胶质瘤和经测序证实具有IDH野生型突变状态的神经胶质瘤。随访时间为0到78个月。在最后一次随访中,有69名IDH突变患者中有58名和92/285名IDH野生型神经胶质瘤患者还活着。与IDH-wt组相比,IDH突变型神经胶质瘤患者的总体生存期显着更长。此外,KPS核心大于等于70的患者的总生存期显着长于KPS得分<70的患者。IDH在多变量分析中,突变状态和KPS评分是独立的预后变量。维罗纳队列中的44例神经胶质瘤中,有13例已部分切除,其中1例已活检。考虑到30例完全切除的手术,IDH突变的存在与更长的总生存期显着相关。
这项研究的结果可以总结如下。在55岁以上的患者中诊断出的弥漫性神经胶质瘤中:低级的IDH突变比四级肿瘤更常见;IDH1 R132H免疫组化是评估IDH突变状态的最佳方法;非规范性IDH突变很少见,仅在低级肿瘤中发现;仅凭ATRX状态不足以推断肿瘤的组织类型。IDH突变与MGMT启动子甲基化和更长的总生存期密切相关。在本文中报告55岁以上患者中诊断出的69例IDH突变型弥漫性神经胶质瘤。来自机构的12例病例包括4例少突胶质细胞瘤和8例星形细胞瘤,占该年龄组在4年内诊断出的弥漫性胶质瘤总数的4.3%。TGCA合并的LGG和胶质母细胞瘤队列的57例病例,包括36例少突胶质细胞瘤和21个星形细胞瘤,占该队列总胶质瘤的18%。在队列中IDH突变胶质瘤的患病率远低于TGCA队列。然而差异可能反映那些队列等级II / III胶质瘤发病率较高相比。已知IDH突变型弥漫性神经胶质瘤大多为低级,在55岁以上的患者中也证实这一证据。实际上IDH突变型神经胶质瘤中有93%是低度肿瘤。
67例IDH突变型神经胶质瘤具有IDH1 R132H突变,一个AO具有IDH 2突变,一个DA具有IDH1 R132C突变。这证实了先前的证据,即IDH1 R132H免疫组化是评估55岁或以上患者诊断出的神经胶质瘤中IDH突变状态的最佳测试方法,并且该年龄组中罕见的非经典IDH突变。先前在55岁以上的患者中发现超过253例弥漫性神经胶质瘤的非经典IDH突变,均为GBM,1而在本研究中,两个具有非典型IDH突变的病例均为LGG。在这两个案例中,一个是AO,一个是DA。没有人有ATRX或TP53突变。这项研究的结果表明,使用IDH1 R132H免疫组织化学筛查所有弥漫性胶质瘤并仅对免疫阴性的低度恶性肿瘤进行测序可以正确评估100%的IDH突变状态且成本低廉。实际上,这一年龄组中LGG的发生率远低于GBM。最近在老年患者中报告了两例小脑IDH突变神经胶质瘤,其中一例具有非典型突变。但是,在出国看病网服务机构的队列中,两个小脑位置的病例均为IDH野生型。
根据IDH突变的星形细胞谱系肿瘤的特征性模式是存在并存的核ATRX丧失,有时还存在强烈的弥漫性核p53免疫染色。ATRX损耗由相应的基因突变,导致而小号仲p53蛋白的免疫染色在> 10%的肿瘤细胞与高度相关TP53弥漫胶质瘤突变。在这项研究中,有41%的IDH突变型星形细胞瘤没有ATRX突变/蛋白质丢失,这与IDH先前发现的ATRX保留相一致在其他研究中,来自大于等于55岁患者的突变型弥漫性神经胶质瘤。相反,虽然ATRX损失被认为是与1P / 19Q codeletion相互排斥的耗氧物质ATRX突变。因此,根据发现ATRX保留不足以在老年患者中建立IDH突变状态或区分星形胶质细胞和少突胶质细胞瘤。反过来ATRX和TP53突变都不存在是ODs的 100%特异性。因此,可能建议在所有具有少突胶质细胞形态的IDH突变神经胶质瘤和具有歧义形态,ATRX保留和p53染色缺失的肿瘤中进行1p / 19q编码测试。
已知IDH突变可诱导广泛的DNA甲基化。在这项研究中,它们也与MGMT启动子甲基化显着相关。尽管IDH突变型神经胶质瘤的预后较好,但亚群具有CDKN2A / B纯合缺失,其外显子组较差。研究表明,IDH突变在大于等于55岁的患者中具有显着的预后价值。因此,尽管年龄被认为是弥漫性神经胶质瘤患者的重要且独立的预后因素,但IDH突变状态似乎独立于患者年龄而预后。总之研究表明,IDH突变虽然不常见,但在大于等于55岁的患者中可存在于弥漫性胶质瘤中,并且主要以IDH1 R132H突变的形式出现。这个年龄段的IDH突变型星形细胞瘤的ATRX保留率很高。因此,在患者中使用ATRX保留作为IDH野生型状态或少突胶质细胞组织型的替代标志时应谨慎。根据发现,建议在所有情况下进行IDH1 R132H免疫组化检查。由于非规范性IDH突变的罕见性,同意在55岁以上的患者中进行广泛的基因测序不值钱。由于该年龄段的IDH1免疫阴性II / III级神经胶质瘤不常见,并且由于本研究中约4%的免疫阴性病例具有非规范性IDH突变,因此出国看病网服务机构建议将它们全部提交给IDH测序。IDH突变状态的评估可能很重要,不仅在预后方面,而且对其治疗意义也很重要。实际上,IDH野生型LGG可能代表没有组织病理学诊断标准的GBM,并且可能需要类似于GBM的其他治疗方法。然后,应在所有IDH中执行1p / 19q编码测试 少突胶质细胞形态的突变病例,以及形态模糊,ATRX保留且缺乏p53免疫染色的病例。
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