胶质母细胞瘤是脑癌中最致命的形式。尽管进行了肿瘤切除，放射和化学疗法治疗，中位生存期仍少于15个月。胶质瘤干细胞样细胞被认为是治疗性和驱动的肿瘤生长。类维生素A已成功用于终末分化急性早幼粒细胞白血病中的癌症干细胞群，但在胶质母细胞瘤中仅显示了适度的成功，尽管肿瘤细胞中存在类视黄醇受体，这表明该癌症对基于视黄酸的疗法有抗性。白血病文献中的一个重要观察结果是，野生型视黄酸受体和致癌融合P毫升-RARA蛋白均可成功响应于视黄酸的更新。尽管由于受体配体结合结构域的突变或导致C末端缺失和异常磷酸化的突变而导致对RA的耐药性出现6，最终这些变化将破坏受体蛋白的更新。此外，如果没有适当的类维生素A受体蛋白更新，RA不会通过经典的RAR激活诱导终末分化的预期效果。维甲酸是维生素A的代谢产物，它在影响分化，细胞增殖和胚胎发生的体内平衡中起着至关重要的作用。视黄酸与视黄酸受体结合并激活RA特异性基因的转录。RAR与类视黄醇X受体形成异二聚体，并与各种视黄酸诱导基因的启动子区域中的视黄酸响应元件结合。RAR和RXR分别由三个独立的基因编码，这些受体属于核受体的超家族，包括甲状腺，过氧化物酶体增殖物激活受体和维生素D受体。RARA和RXRA是对类维生素A受体最深入的研究，它们可以结合视黄酸的各种结构异构体。所有反式RA结合RAR，9-顺式结合到RAR和RXR受体。
　　 转录后，RA受体通过蛋白酶体途径所必需的最佳转录活性降低。尚未阐明RA受体降解的确切机制以及蛋白酶体降解在基础蛋白更新中发挥的作用。为了使RAR和RXR降级，必须进行适当的翻译后修饰。对于RAR和RXR，已经观察到几个PTM。例如，磷酸化被认为是对受体的转录活性必不可少的。较少研究的PTM之一由sumoylation表示。在某些蛋白质家庭肽在蛋白质降解中发挥作用。尽管相扑和遍在蛋白的氨基酸序列不同，但是这些蛋白具有相同的结构相似性，并且都需要一个三步酶促途径才能将肽与目标蛋白中的赖氨酸残基共价连接。相扑/泛素的混合签名可以作为蛋白酶体在各种生物系统中降解的信号。核受体的糖基化通常与转录抑制有关，但其他报道也描述了糖基化是转录的激活因子。研究特定于类视黄醇受体人已经发现，相扑修改与所述受体蛋白的稳定化相关联，输送到细胞核和可能是由于炎症。但没有报道说类维生素A受体的磺酰化可能与蛋白酶体降解有关。
　　 在这里揭示了正常神经干细胞中类维生素A受体中的蛋白酶体降解机制涉及磺酰化，泛素化和由含缬沙蛋白的蛋白识别。Sumo1修饰可稳定受体并通过泛素化发出其他修饰信号。随后，修饰的受体与VCP伴侣结合，并且两种蛋白质都被蛋白酶体降解。此外发现所有反式视黄酸诱导VCP表达，从而产生ATRA-VCP正反馈环，从而增强类维生素A受体的蛋白酶体降解。相反，神经胶质瘤干样细胞中的降解途径被破坏，导致缺乏转录活性并且不能被蛋白酶体识别的受体的高分子量形式的积累。而且，修饰的类维生素A受体的积累发生在药物治疗之前。因此，类维生素A受体的转录活性降低是由于在相扑修饰步骤之后发生的蛋白酶体降解途径阻滞。
　　 为了确定神经胶质瘤干样细胞中的维甲酸抗性是否是由于异常的翻译后修饰引起的，评估了维甲酸受体的蛋白表达水平。核裂解物的蛋白质印迹分析表明，正常鼠神经干细胞表达51kDaRARA蛋白，并且正如预期的那样，响应所有反式RA的处理，RARA蛋白被下调。为了证实RARA的下调是由于蛋白酶体途径的蛋白质降解引起的，用MG132处理了MNSCe14细胞系。正如预期的那样，用MG132进行的治疗可阻断RARA的蛋白酶体降解）。相比之下，在人GSC923和GSC827中添加ATRA不会导致RARA蛋白的下调，表明在存在和不存在ATRA处理的情况下，GSC923和GSC827均显示出高分子量形式的RARA。对于细胞质裂解物观察到相同的RARA蛋白表达模式。结果表明，蛋白酶体对RARA的识别在GSC中消失了，这表明这可能部分是由于RARA的翻译后修饰异常所致。
　　 以前的报告表明，磷酸化是蛋白质RARA最佳转录活性的必要的修改，确定这是否修改存在于GSC中。磷酸特异性RARA抗体不是市售的。取而代之的是使用2DWestern印迹评估MNSC和GSC827中RARA的磷酸化状态。Western印迹显示，响应ATRA，GSCRARA未能被磷酸化，而MNSC被磷酸化了。随后使用启动子荧光素酶测定法测试了几种GSCRARA蛋白的转录活性。作为对ATRA治疗的反应，一种特定的视黄酸应答元件启动子荧光素酶报道分子证明，与MNSC对照相比，GSCRARA的转录活性降低了40-60％。这些结果表明，GSCRARA缺乏磷酸化，这可能导致其转录活性降低。此外，GSC中RARA转录功能的降低可能是由于RARA的异常HMW形式的积累而无法被蛋白酶体识别和降解。
　　 HMWRARA蛋白代表在其它细胞系RARA的各种SUMO化和泛素化形式的。免疫沉淀和Western印迹分析表明，Sumo1肽对GSC827和GSC923中的内源性RARA蛋白进行了翻译后修饰。假设在正常神经干细胞和神经胶质瘤干细胞样细胞的蛋白质更新过程中，SUMO化可能在调节RARA的蛋白酶体降解中起作用。首先，相扑IP在正常的MNSCRARA中未检测到相扑修饰，但在GSC中清楚地显示了相扑带。糖基化是一个动态过程，可以快速从给定的目标蛋白中添加或去除共价相扑修饰。为了确定正常MNSC细胞中sumoylation的缺乏是抑制还是快速去除sumo修饰的结果，进行了两个单独的实验。在一个实验中，添加了N-乙基马来酰亚胺，这是SENP蛋白酶的化学抑制剂，可防止相扑修饰的去除。添加后，RARAWestern印迹现在显示MNSC表达51kDaRARA和HMW形式的RARA蛋白。这些细胞的内源性Sumo免疫沉淀物表明MNSCRARA被Sumo1肽磺酰化，而在较小程度上被Sumo2肽磺酰化。在另一个实验中，出国看病服务机构测量了MNSC细胞中RA治疗的时间过程，并观察到相扑带出现在RARA的其他PTM之前。因此，正常和神经胶质瘤RARA被Sumo1肽磺酰化。RARA的Sumo1修饰表示作为蛋白酶体途径的一部分的额外翻译后修饰，但该途径在神经胶质瘤中被破坏。为了探测RARA的磺酰化后是否发生泛素化，出国看病服务机构用ATRA和MG132处理MNSC细胞12小时。内源性RARA蛋白在0和12小时的时间点进行免疫沉淀，然后进行蛋白质印迹分析。如预期的那样，出国看病服务机构在12h观察到了多泛素化RARA蛋白的增加，这表明RARA的磺酰化作用先于其他泛素化和通过蛋白酶体途径降解。
　　 为了使用适合基因操作的更强大的模型，评估了HEK293细胞中RARA的降解。进行了一个时间过程以研究HEK293中的正常RARA蛋白表达，HEK293是一种阳性对照细胞系，可通过RARE启动子荧光素酶测定法测量其表达转录活性RARA蛋白。在零时间点，一定比例的HEK293RARA可能被磺酰化，并在6和12h时间点出现额外的PTM，这些修饰的蛋白质在蛋白酶体降解之前积累。在存在和不存在ATRA治疗的情况下，都会发生PTM和HEK293RARA降解，表明相扑和泛素修饰可能对基础RARA蛋白更新非常重要。内源性IPWestern印迹分析表明，HEK293RARA被Sumo1进行了磺酰化，而Sumo2进行了较小程度的修饰。用MG132处理证实蛋白酶体发生了HEK293RARA的降解。经ATRA和MG132处理的HEK293RARA的IPWestern印迹显示，在12h时间点，泛素化RARA蛋白的积累增加。这些结果表明，与MNSCRARA相似，HEK293细胞中的RARA被磺酰化和泛素化，并表明HEK293代表了一种强大的细胞系，可能对进一步研究RARA的生物学特性有用。
　　 使用小干扰RNA来敲低Sumo1肽的表达。Western印迹分析显示Sumo1-RARA蛋白以及51kDaRARA蛋白的表达减少，表明Sumo1肽稳定了RARA蛋白。Sumo1siRNA和RARE启动子荧光素酶报道基因在HEK293细胞中的共转染导致ATRA诱导的转录活性降低了70％。接下来，用Sumo1siRNA转染HEK293细胞48小时，然后用MG132处理12h，以确定51kDaRARA蛋白的降解是否是由于蛋白酶体引起的。有趣的是，Sumo1修饰的丢失并不能恢复51kDaRARA，而是通过蛋白酶体的另一条途径导致RARA降解。另外，如SUMOplot分析软件所预测的，定点诱变用于突变RARA蛋白中的前三个相扑基序。将赖氨酸突变为精氨酸可保持正确的电荷，但可防止相扑肽与赖氨酸残基的共价结合。响应RA，所有三种突变稳定细胞系均与野生型相比具有降低的转录活性，这表明在每个位点均可发生单sumoyoyation，支持这一假设，即相扑修饰对于最佳的ARAA转录活性是必需的。
　　 为了进一步了解相扑和泛素信号在RARA蛋白更新中的作用，试图鉴定与翻译后修饰的RARA蛋白相互作用的蛋白。在旨在鉴定与所有形式的RARA结合的未知蛋白质的实验中，对与表位标记的RARA结合的蛋白质进行了免疫共沉淀，并使用LC-MS/MS鉴定了在没有视黄酸处理的情况下与RARA蛋白质相互作用的蛋白质。通过蛋白质印迹证实了RARA-DDK蛋白在HEK293中的表达。IPWestern分析显示DDK抗体成功免疫沉淀了RARA-DDK蛋白。此外，作为阳性对照，观察到RARA-DDK蛋白共免疫沉淀了RXRA蛋白，而RXRA蛋白是RARA的已知结合伴侣。RARA-DDKIPLC-MS/MS数据确定了含缬氨酸的蛋白质是与RARA相互作用的蛋白质之一。为了验证LC/MS结果，出国看病服务机构在HEK293细胞中免疫沉淀了内源性RARA，并通过Westernblot检测了VCP蛋白，说明了与RARA结合的VCP的存在。
　　 VCP是AAA+ATPase家族的成员，在涉及蛋白质相互作用的各种重要细胞过程中起作用。VCP可以作为segregase的功能，从蛋白质复合物中提取泛素化或相扑/泛素化的目标蛋白，并将其引导至蛋白酶体。为了确定VCP是否调节RARA的蛋白酶体降解，使用了两种互补的方法。首先，使用siRNA敲低HEK293细胞中的VCP表达。蛋白质印迹分析显示RARA的sumoylated和其他HMW形式的积累，表明蛋白酶体降解受阻。VCPsiRNA和RARE启动子荧光素酶报道基因在HEK293细胞中的共转染导致ATRA诱导的转录活性下降了35％。另外，用非ATP竞争性抑制剂NMS-873抑制VCP导致了磺酰化RARA蛋白的积累。出国看病服务机构发现单独用ATRA进行治疗可诱导VCP的表达。为了更好地了解VCP在RARA的蛋白酶体降解途径中的作用，用ATRA，环己酰胺和MG132的各种组合处理了MNSC。CHX阻止蛋白质翻译，这将阻止任何新的VCP蛋白质表达。仅响应ATRA，RARA下降，VCP上升，符合预期。用ATRA和CHX进行的治疗均显示VCP降解，这可能是由于蛋白酶体引起的。MG132的添加会阻止蛋白酶体，导致VCP积累。因此，ATRA刺激VCP蛋白的产生。而且，降低的VCP翻译，降解或两者均导致无法被蛋白酶体识别的RARA的高分子量形式的积累。这些结果表明，ATRA诱导RARA和VCP的蛋白质更新，并产生增强蛋白酶体降解途径的正反馈回路。
　　 RARA必须作为异二聚体结合到RXRA，以激活RA诱导的转录7。RXRA与RARA属于同一核受体家族；然而，RXRA是主要调节的是同二聚体与本身，以及与众多其他核受体hetrodimerizes影响许多生物途径的转录激活。由于核受体家族的成员具有相同的域结构，因此假设RXRA蛋白的转化与RARA相似，并且RXRA会经历相同的PTM和降解途径。分析了MNSC和GSC中RXRA蛋白的表达。MNSC表达51kDaRXRA蛋白，响应ATRA处理，RXRA蛋白被下调。用MG132处理MNSC证实RXRA降解是由于蛋白酶体途径引起的。相反，GSCRXRA蛋白未降解。响应9-顺式RA的治疗，特定的视黄酸应答元件启动子荧光素酶报告基因表明，与MNSC对照相比，GSCRARA的转录活性降低了40-80％。为了确定正常的RXRA是否被磺酰化，使用了免疫沉淀和Western印迹分析来探测被磺酰化的RXRA蛋白。HEK293中的内源性RXRA被Sumo1和Sumo2肽均磺酰化。证实，HEK293RXRA降解是由于蛋白酶体引起的。用ATRA和MG132处理的HEK293RARA的IPWestern印迹分析显示，在12h时间点，泛素化RXRA蛋白的积累增加。HEK293，MNSCRXRA被Sumo1和Sumo2磺酰化，并且在用RA治疗12小时后，MNSCRXRA的泛素化增加。293中内源性RXRA的免疫沉淀与VCP结合，使用siRNA敲低VCP蛋白会导致HMWRXRA蛋白积聚。VCPsiRNA和RXRE启动子荧光素酶报道基因在HEK293细胞中的共转染显示9-顺式RA诱导的转录活性降低了30％。类似于RARA，正常的MNSCRXRA被磺酰化和泛素化，随后被蛋白酶体降解。敲低HEK293细胞中的VCP导致磺酰化和HMWRXRA积累，表明降解受VCP蛋白调控。RXRA蛋白更新失败可能会影响需要RXRA的多种异二聚体，并可能改变许多生物学途径。
　　 在出国看病服务机构的工作模型中，Sumo1修饰具有双重作用：可稳定RARA蛋白免受不必要的降解，并通过泛素化和随后的蛋白酶体降解作为进一步修饰的信号。VCP蛋白有助于修饰的类维生素A受体的降解。虽然VCP结合到受体，但身份不明的VCP伴侣分子可能参与将VCP引导至蛋白酶体。此外，ATRA诱导VCP表达，形成正反馈回路，以调节RARA的蛋白酶体降解。在神经胶质瘤干样细胞中，类维生素A受体蛋白的更新过程被破坏。尽管确切的缺陷尚不清楚，但RARA和RXRA都无法被蛋白酶体识别和降解，因此，它们在GSC中以苏木素化和HMW形式积累，表明蛋白酶体途径中存在常见缺陷，影响了这两个核受体。在文献中强有力的证据链接类视黄醇受体的分解代谢，其转录激活。研究表明，RA会诱导受体的下调，这被称为配体诱导的蛋白酶体降解。关于类维生素A受体，受体蛋白更新对于最佳转录功能是必需的。受体蛋白中特定位置的定点诱变或缺失会阻止适当的PTM，从而破坏DNA结合或与异二聚体伴侣的相互作用并最终破坏转录活动。没有类维生素A受体的转录活性，诱导终末分化的预期RA特异性基因将不会被转录，因此终末分化将不会发生。
　　 RA是一种用于早幼粒细胞白血病的成功的分化疗法。RA诱导野生型RARA和致癌融合P毫升-RARA蛋白的受体蛋白更新。病人对RA产生抗药性的一种方法是获得RARA蛋白中的基因突变，该基因突变会导致适当的PTM丢失，从而导致配体诱导的受体蛋白酶体降解和转录活性的丧失。此外，合成类维生素A激活RA特异性基因，但不能下调RARA或P毫升/RARA蛋白水平，则不能根除急性早幼粒细胞白血病。也许合成的类维生素A激活了类维生素A受体独立途径。类维生素A受体如何识别并传递到蛋白酶体的确切机制尚不清楚。在这里显示正常的RARA和RXRA蛋白被sumoylation和泛素化后翻译修饰，然后被蛋白酶体途径降解。出人意料的是，在没有外源配体的情况下发生了翻译后修饰和蛋白酶体降解，表明该过程可能是基础蛋白质更新所必需的。
　　 此外，发现RARA与含valosin的蛋白质ATPase结合，该segregase可从蛋白质复合物中提取客户蛋白质并将其转运至蛋白酶体。该蛋白在正常的神经干细胞中的敲低导致翻译后修饰的RARA和RXRA蛋白的积累，并降低了视黄酸诱导的转录。令人惊讶的是，单独的ATRA治疗可增加VCP表达。响应于ATRA，RARA和VCP都被蛋白酶体降解，并且ATRA在ATRA和VCP之间产生正反馈回路，以增加蛋白酶体降解途径。出国看病服务机构发现在胶质瘤干细胞样细胞中RARA和RXRA蛋白的更新被阻断，并且RARA转录活性被破坏。胶质瘤细胞表达甚至在视黄酸处理之前就已积累的磺酰化和高分子量RARA和RXRA蛋白。此外，sumoylated和HMWRARA和RXRA蛋白不能被蛋白酶体途径识别和降解。因此假设神经胶质瘤细胞对视黄酸的固有抗性可能是由于相扑修饰后，但在RARA和RXRA蛋白被递送至蛋白酶体之前发生的类维生素A受体降解途径的阻滞。未来的工作将集中于确定途径中的确切缺陷，这将扩大出国看病服务机构对视黄酸耐药性的理解。
　　 出国看病服务机构的研究为蛋白酶体降解在类维生素A受体中的重要性提供了新的见识。与RARA受体组成型表达并因此具有转录活性的观点相反，证明了通过相扑和遍在蛋白降解是转录活性所必需的。视黄酸的多效作用可能先前已经掩盖了胶质瘤中蛋白酶体降解与转录活性之间的联系。有力的证据表明RARA被蛋白酶体途径降解，蛋白质更新与受体的转录活性有关。也许中断RARA的蛋白酶体处理胶质瘤被错过了，因为RA的受体无关的效应在当时是未知的。虽然神经胶质瘤细胞似乎响应类视色素处理而分化，但缺乏响应RA处理引起的RARA降解将表明蛋白质更新和RARA转录功能而不是组成活性方面存在缺陷。为了了解神经胶质瘤中的维甲酸抵抗力，研究正常神经干细胞和神经胶质瘤干样细胞中的类维生素A受体。在胶质瘤中，类维生素A受体的转换机制被破坏了。胶质瘤干细胞样细胞表达高分子量形式的RARA和RXRA，无法被蛋白酶体识别并且缺乏转录活性。修饰的类维生素A受体在药物治疗之前蓄积，表明癌细胞可能在相扑修饰后发生的蛋白酶体降解途径中普遍存在缺陷。由于RXRA与其他核受体二聚，因此RXRA蛋白更新的中断可能会影响多种生物途径。发现Sumo1和VCP调节正常细胞中类维生素A受体RARA和RXRA的转录活性和蛋白酶体降解。Sumo1修饰可稳定受体，使其免受不必要的降解，并作为信号通过泛素化进行进一步修饰，然后被VCP复合物识别为蛋白酶体降解。ATRA-VCP正反馈回路在RARA蛋白更新中提供了另一层调节。这些发现突出了与类视黄醇受体的蛋白酶体降解有关的翻译后修饰的重要性，从而使对该重要受体家族的更好理解和潜在治疗靶标成为可能。