多形胶质母细胞瘤是最常见的侵袭性癌症，始于大脑。在欧洲，它占所有原发性脑肿瘤的45％，每年每十万名成年人中有四到五次发病。如果不进行治疗，则诊断后的平均总生存期仅为3个月，而采用最佳的手术和辅助疗法只能延长至14-15个月。尽管世界各地进行大量的临床试验，GBM仍未满足医疗需求，因为新策略未能显示出90年代后期批准的烷化剂替莫唑胺的治疗标准得到改善。表型筛查活动是最终进入临床的一流药物的主要来源。与以靶标为中心的策略相比，这些基于细胞的复合筛选可观察细胞表型的变化，从而涵盖整个细胞的复杂性。这在癌症中尤为重要，因为冗余，补偿机制，通路串扰和可塑性是常见且难以预测的。特别是GBM在分子，遗传和表观遗传水平上显示出高度的异质性，因此，必须使用能够概括疾病的模型，包括选择各种神经胶质瘤细胞类型。即使是偶然的，通过在适当的细胞模型上进行表型筛选来发现命中也可以提高临床可翻译性的几率。例如，在源自患者的神经胶质瘤细胞中进行的表型筛选再利用活动表明，双硫仑和铜的组合介导了有希望的活性和对TMZ的重新敏化，尤其是在神经胶质瘤干细胞样细胞中，该组合目前处于临床阶段。
　　 在出国看病网的进行表型筛选后，通常会进行目标参与卷积步骤，以鉴定目标和作用机制。然而，适当的目标ID策略必须为每个单独的生物学靶标和临床前药物被优化，代表技术上具有挑战性步骤。实际上，某些候选药物在未真正了解其作用机理的情况下已获得监管部门的批准，由于缺乏适当的生物标记物，可能会阻碍进一步的临床开发活动。通过结合结合基于配体的药物设计和所选癌细胞系的表型筛选的务实策略，实验室产生一系列聚焦于小分子的化合物，这些化合物以4-氨基或6-甲基氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶为特征核心，并发现有效的“表型”命中和铅化合物，这些化合物具有多种抗癌特性，包括细胞周期停滞，促凋亡和抗迁移活性。由于这些支架通常在激酶抑制剂中发现，因此命中和导联的kinome分析可以快速阐明其靶标，并生成结构活性关系以支持后续的优化活动。这种运动导致，例如在强效SRC/nonABL激酶抑制剂eCF506的发现选择性mTOR抑制剂eCF309或强效FLT3/AXL/RET抑制剂eSM156。
　　 使用内部开发的库进行表型筛选活动，在寻找小分子抑制剂，可能会影响神经胶质瘤细胞的增殖。筛选中使用的文库代表高度集中的化学多样性空间。这个空间是富含已经显示，能够应用于多种蛋白质，脂质和非典型激酶的生物活性化合物，因此在促进对潜在SAR的解释的同时，增加发现针对神经胶质瘤细胞的有效命中的机会。
　　 使用TMZ和拓扑异构酶I抑制剂SN-38作为阳性对照，测试总共100种化合物对U87和T98胶质瘤细胞系的抗增殖活性。用文库成员以三种不同浓度处理细胞5d，并使用PrestoBlue试剂测定细胞活力。从相应的剂量反应曲线计算出最大有效浓度值的一半，绘制为热图以促进数据分析表示无活性，深到浅绿色到黄色的转变表明EC降低值。包含相应的EC50值±SEM。虽然发现基于支架2的化合物总体上比来自支架1的化合物具有更高的活性，但特定的一族分子显示出最高的活性。目前正在临床开发中的候选药物。
　　 为了证实结果，针对最有效的命中值重复进行U87和T98细胞活力测定，所有这些都在特征处具有2-氨基-1,3-苯并恶唑部分C3位），使用7点半对数剂量反应研究。INK128和SN-38用作阳性对照。eCF333和eCF334呈现与eCF325相同的剂量反应曲线，因此为清楚起见，未包含其数据。eCF324是在两种细胞系的最有效的化合物，显示EC在U87和T98细胞，分别和图10的13值纳米;值优于阳性对照INK128和SN-38。在前导化合物eCF324和eCF311之间观察到大于200倍的活性缺口；后者在N1处呈现甲基-1-3-二氧戊环而不是甲基环戊烷。其余热门歌曲均显示EC值在100–150nM的范围内。在结构上，这些衍生物在N1位烷基的大小以及该部分中是否存在氧原子方面有所不同。均未显示出比eCF324更高的效价，表明该化合物中发现的最具亲脂性的环戊基甲基对于活性而言是最佳的。
　　 为了将表型命中的抗增殖活性与潜在靶标相关联，利用先前从这些化合物获得的激酶谱数据。所有命中均显示出对mTOR激酶的高抑制活性，其中eCF309的选择性最高=15nM；IC50=981nM），而eCF324的效力最高=1.8nM；IC50=3.5nM）。选择性mTOR抑制剂eCF309表现出的抗增殖能力强烈支持mTOR抑制在命中抗增殖特性中的作用。另一方面，eCF324优异的抗神经胶质瘤活性表明，其多药理学性质有利于抑制神经胶质瘤细胞的增殖。为了研究PI3K抑制的可能作用，使用选择性泛PI3K抑制剂pictilisib在U87和T98细胞中进行了其他细胞生存力研究。尽管eCF309和eCF324均显示出比pan-PI3K抑制剂GDC0941更高的活性，但该选择性抑制剂对T98的活性却低于uM和U87细胞中的低uM活性。
　　 接下来，为了测试双重PI3K/mTOR抑制是否可以为靶向神经胶质瘤细胞提供治疗优势，通过在一系列浓度下将eCF309与pan-PI3K抑制剂GDC0941结合在U87和T98细胞中进行细胞活力研究。这些组合的协同作用，区域代表协同作用和拮抗作用。在大多数组合中都观察到强的协同活性，在T98细胞中100nM的eCF309和300nM的GDC0941上发现最大的协同作用。由于已知这两种化合物都是mTOR和PI3K的选择性抑制剂，因此研究表明，同时抑制mTOR和PI3Ks可增强这两种神经胶质瘤细胞系的抗增殖作用。U87和T98细胞之间最大协同作用的组合剂量有所不同，表明每种细胞系中这些致癌驱动因子的表达不同。
　　 还使用eCF324和GDC0941进行组合实验，它们也发现协同活性。这可能表明eCF324对mTOR和PI3K的固有抑制特性没有达到最佳的协同抗癌活性的最佳平衡，并且额外的PI3K抑制作用还可以进一步促进这种药物介导的抗增殖作用。然而，由于eCF32412的已知混杂性，需要谨慎考虑这种可能的解释。在这种情况下，可能会产生其他脱靶效应。为了在更具临床意义的模型中证实结果，接下来测试患者来源的GBM细胞系G317。该细胞系中最有效的命中对细胞生长的抑制。表示G317中的GI50值。选择获得GI50值而不是EC50来确定化合物是介导细胞生长停滞还是细胞死亡。与先前的结果一致，化合物eCF324的功效最高，其GI50值为7.2nM，类似于INK128但高于拓扑异构酶I抑制剂SN-38和pan-PI3K抑制剂GDC0941。从数据eCF333和eCF334显示相同的剂量反应曲线来eCF325。所有化合物均可诱导细胞死亡，这与先前在乳腺癌和前列腺癌细胞中观察到的这些化合物的抗增殖作用模式形成鲜明对比。值得注意的是，选择性mTOR抑制剂eCF309在患者来源的细胞中显示出非常强的活性，GI50值65nM，进一步证明mTOR在促进GBM中细胞生长和存活中的核心作用。
　　 为了在更能代表肿瘤微环境的条件下测试化合物，将G317细胞在3D和预先形成的球体中进行培养，这些球体在浓度范围中用eCF309，eCF324和阳性对照处理8天。抑制剂诱导剂量依赖性的G317球体尺寸的减小，其中eCF324和INK128表现出最有效的抗增殖活性。在两种非癌细胞系中对命中的安全性概况进行初步评估：人脑血管周细胞和小鼠脑内皮细胞。细胞活力研究表明，筛选的结果影响浓度高于3uM的正常细胞增殖，比减少胶质瘤细胞增殖所需的剂量高2至3个数量级。基于筛选中发现的先导化合物，设计并合成五种新的衍生物，以汇集从筛选的SAR中观察到的最佳结构特征。设计化合物eDB001以将在eCF324的C3处发现的2-氨基-1,3-苯并恶唑基团并入支架2中。其他四种化合物结合在eCF324的N1位置发现的环戊基甲基部分和在每个支架的C3处的氮杂吲哚或吲唑基团，以进一步探索SAR。eDB002和eDB003显示在同一组较eSM145，还发现KW-2449，是有效的FLT3，ABL和相关激酶的多激酶抑制剂。吲唑基团用于eDB004和eDB005以模拟选择性泛-PI3K抑制剂GDC0941的结构性质。尽管eDB001和eDB002的EC50值未达到eCF324的效力，但它们在两种细胞系中均显示出高活性。鉴于新衍生物的结果，未来的优化策略应集中在支架1上，并在C3处修饰2-氨基-1,3-苯并恶唑部分，在N1处修饰亲脂基团，以增强活性。
　　 通过对100个吡唑并嘧啶的聚焦库进行基于细胞的筛选，已鉴定出一系列结构相关的吡唑并嘧啶衍生物是神经胶质瘤细胞增殖的有效抑制剂。最有效的命中表现出针对U87和T98胶质瘤细胞系的亚微摩尔活性。命中属于已知靶向mTOR或PI3K的一组化合物，包括选择性mTOR抑制剂eCF309和双重PI3K/mTOR抑制剂eCF324。根据在这项研究中确定的SAR，设计新的衍生物，这些衍生物对神经胶质瘤细胞表现出有效的活性，但不优于前导化合物eCF324。与市售选择性pan-PI3K抑制剂GDC0941进行协同研究提供了在神经胶质瘤细胞生长中同时抑制mTOR和PI3Ks协同作用的证据。在2D和3D的患者源性神经胶质瘤细胞模型中也验证最有效的命中。这项工作进一步支持为能够面向的PI3K或mTOR的激酶的抑制剂搜索GBM。