胶质瘤是世界上最常被诊断的颅内恶性肿瘤，其发病率和死亡率很高。它们的特征在于快速转移和侵袭性浸润，导致预后不良。根据2016年提出的世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类，胶质母细胞瘤是最常见的恶性神经胶质瘤类型，即使经过系统治疗，胶质母细胞瘤患者的平均生存时间也只有约15个月。证据表明，神经胶质瘤的恶性程度可能归因于肿瘤发生中的各种遗传和表观遗传学改变。探索神经胶质瘤侵袭性发展的分子机制可能为致命的癌症提供新的治疗目标。Poly结合蛋白2是一种39kDa的RNA结合蛋白，可以调节RNA稳定，翻译沉默和增强。它包含三个K同源结构域，用作主要的RNA识别区域。PCBP2的失调可能通过RNA结合途径破坏多个生物过程。例如，PCBP2可以调控诺如病毒等各种RNA病毒的基因组环化和复制，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒，脊髓灰质炎病毒和丙型肝炎病毒。PCBP2的上调可能有助于核糖体起始复合物的形成，从而增强病毒的复制。另外，PCBP2可以调节细胞的生长，迁移和侵袭。在几种癌症中都观察到了PCBP2表达异常，例如胃癌和肝细胞癌。在神经胶质瘤中，敲除PCBP可能抑制肿瘤细胞的增殖和生长。PCBP2可能在神经胶质瘤的病因中起癌基因的作用。然而，PCBP2在神经胶质瘤进展中的分子机制尚不清楚。
　　 在这项研究中，出国看病服务机构调查了PCBP2在神经胶质瘤组织和细胞中的表达，并揭示了其在神经胶质瘤进展中的功能。此外，构建了细胞实验以探索神经胶质瘤发病机理中PCBP2致癌功能的分子机制。本研究在哈里森国际和平医院进行。本研究共纳入106例经病理检查诊断为成人的神经胶质瘤患者。从接受外科手术的患者中收集脑胶质瘤组织和相应的非癌组织，并立即放入液氮中。然后将标本保存在-80℃，以备下一步使用。在组织收集之前，没有患者接受过任何治疗，例如化学疗法或/和放射疗法。胶质瘤患者的临床特征也可以从医疗记录中获得。该研究得到哈里森国际和平医院伦理委员会的批准。所有患者均签署了书面知情内容。人神经胶质瘤细胞系U251和正常神经胶质细胞HEB购自上海生物科学研究所细胞库。将细胞在补充有10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle's培养基中培养。将细胞在37℃和5％CO2下孵育。每2-3天更换一次细胞培养培养基。
　　 按照制造商的说明，使用TRizol试剂提取神经胶质瘤组织和细胞标本的总RNA。使用NanoDrop1000分光光度计检查RNA样品的质量和浓度。互补DNA是通过逆转录反应合成的，该反应使用PrimerScriptRT试剂盒完成。使用qRT-PCR估算PCBP2mRNA的相对表达。qRT-PCR反应由SYBRGreenPCRMasterMix在7900Real-timePCRSystem中进行。胶质瘤组织样品中PCBP2的蛋白表达通过链霉亲和素-过氧化物酶的IHC分析染色进行估算。根据制造商的说明，使用了IHC套件。使用的抗体包括抗PCBP2抗体。两名独立研究者记录了染色结果，他们不知道组织病理学特征和患者信息。根据以下标准对染色结果评分：0：染色小于5％；1：染色6–25％；2：染色26–50％；3：染色51–75％；4：染色＞75％。得分小于1的患者被确认为阴性染色，否则，患者被确认为阳性染色。
　　 为了研究PCBP2在神经胶质瘤进展中的作用，设计了siRNA-PCBP2来沉默体外神经胶质瘤细胞中PCBP2的表达。SI-PCBP2和相应的阴性对照序列通过GenePharma公司合成。将获得的序列克隆到pLV-shRNA质粒中，然后使用Lipofectamine2000转染到胶质瘤细胞中。转染48小时，进行qRT-PCR以测量PCBP2的相对表达，以估计转染效果。此外，为了探索神经胶质瘤进展中PCBP2功能的分子机制，还构建了si-FHL3和FHL3过表达重组质粒以及相应的对照。效果PCBP2对神经胶质瘤细胞的增殖进行了通过MTT测定法进行测试。培养48小时后，将转染的细胞接种到96孔板中。将细胞在特定条件下孵育。当将转染的细胞分别孵育0、24、48和72小时时，每个孔分别添加20ulMTT，并且需要额外的4小时来保持孵育。然后，加入150ul二甲基亚砜将紫色甲for溶解15分钟。然后通过酶标仪读取490nm处的吸光度。
　　 细胞迁移和侵袭能力分别用涂有或未涂有Matrigel的侵袭实验室进行了测试。在侵袭实验的上腔室中加入200ul无血清培养基，在下腔室中填充含10％FBS的培养基。将密度为4×104每毫升的转染细胞接种到上室中。孵育48小时，通过结晶紫染色确定底部室的细胞数，并使用倒置显微镜在10个随机视野中进行定量。采用膜联蛋白V/PI双重染色流式细胞术检测细胞凋亡率。转染48小时后，收集细胞并调节至1×106每毫升的密度。然后根据制造商的说明书，通过膜联蛋白VFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒对它们进行染色。通过流式细胞术评估细胞凋亡率。每个测试重复三次。FHL3基因的3'-非翻译区含有PCBP2的假定结合位点。PCR方法用于扩增FHL3的3'-UTR，然后将其克隆至含有萤火虫荧光素酶报道基因的p-GL3载体。另外，还扩增了具有PCBP2结合位点的突变序列的FHL3的3'UTR，并将其克隆至载体。然后将载体转染到有或没有siPCBP2载体的U251细胞中。转染48小时，收获细胞，并使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性，并标准化为Renilla活性。
　　 使用蛋白质印迹分析检测蛋白质的表达。使用具有蛋白酶抑制剂的预冷放射免疫沉淀测定缓冲液从细胞中分离出蛋白质样品，并用二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒。相同的蛋白质在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并在48V下转移到聚偏二氟乙烯膜上3.5小时。然后，将5％牛血清白蛋白用于在室温下孵育膜2小时。用Tween20用缓冲盐水洗涤后，将膜封闭60分钟，并在添加一抗后在室温下孵育1小时：小鼠抗人接下来，将膜与山羊抗兔二抗一起孵育，并在紫外透射仪下观察。B-肌动蛋白被用作内部对照。基于灰度值定量蛋白质水平。每个测试重复三遍。英国剑桥，埃夫伯里大厦B-肌动蛋白被用作内部对照。基于灰度值定量蛋白质水平。每个测试重复三遍。英国剑桥，埃夫伯里故居。B-肌动蛋白被用作内部对照。基于灰度值定量蛋白质水平。每个测试重复三遍。
　　 常规培养20只实验老鼠，腹股沟上部接种U251细胞，进行皮下注射。将他们平均分为两组：实验组和对照组，每组10例。皮下肿瘤的长轴和短轴每3天测量一次，肿瘤体积：V＝1/2×a×b2。4周后，杀死裸鼠以测量肿瘤重量。所有数据分析和图形绘制分别使用SPSS18.0软件和GraphPadPrism版本5.0进行。连续变量显示为平均值±标准偏差。通过学生t检验比较病例组和对照组。x2检验用于探索的关联PCBP2与胶质瘤患者的临床参数的表达。
　　 本研究共纳入106名神经胶质瘤患者，其中包括55名男性和51名女性。胶质瘤患者的平均年龄为54.28±11.025岁。有癌症家族史的患者为44例，其中49例的肿瘤大小大于5cm。根据世界卫生组织的分类，确诊65例为I-II期，41例为III-IV期。使用qRT-PCR检测神经胶质瘤组织和细胞中PCBP2的mRNA水平。分析结果表明，神经胶质瘤组织和细胞中PCBP2mRNA的水平显着高于非癌组织和正常细胞，然后还检测了神经胶质瘤组织中PCBP2的蛋白水平。通过蛋白质印迹分析。数据显示，PCBP2在胶质瘤组织蛋白水平显著增加了与非癌性组织。此外，IHC被用于研究PCBP2的表达胶质瘤组织中的蛋白质。PCBP2表现出非癌组织中胶质瘤组织的强阳性表达，但弱阳性表达。在神经胶质瘤组织中，阳性率为87.73％，而在邻近的正常组织中，阳性率仅为16.98％。神经胶质瘤组织中PCBP2蛋白的表达明显高于邻近的正常组织。评估了胶质瘤患者PCBP2表达与临床参数之间的关系。根据神经胶质瘤组织中PCBP2mRNA的平均水平，将入选患者分为高表达组和低表达组。PCBP2的高表达与肿瘤的大小呈正相关，且其进入WHO晚期。但是，PCBP2的表达与神经胶质瘤患者的年龄，性别，家族史和KPS评分无关。
　　 为了研究PCBP2在神经胶质瘤病因中的作用，在出国看病服务机构的研究中构建了si-PCBP2载体。转染后，通过qRT-PCR和westernblot分析检测si-PCBP2的转染效率，si-PCBP2转染的神经胶质瘤细胞中PCBP2的表达显着下调。在研究中估计了PCBP2对神经胶质瘤细胞生物学行为的影响。MTT分析表明，敲低PCBP2可以明显抑制神经胶质瘤细胞的增殖。与si-NC组相比，si-PCBP2转染后，神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力也受到显着抑制。此外，与si-NC组相比，si-PCBP2转染的细胞的凋亡率明显增加。因此，敲除PCBP2可以明显抑制神经胶质瘤细胞的进程。在研究中进行了qRT-PCR和Westernblot研究了FHL3在si-PCBP2转染细胞中的表达。随着PCBP2的敲低，FHL3的表达在神经胶质瘤细胞中明显增加。PCBP2可以调节FHL3在神经胶质瘤中的表达。此外，采用westernblot方法研究了siPCBP2转染的胶质瘤细胞中TGF-B/Smad信号通路蛋白的表达，结果表明TGF-B1，p-Smad2和p-Smad7蛋白的表达为PCBP2敲低后神经胶质瘤细胞中的表达下调。但是，Smad2和Smad7的表达没有显示出明显的变化。
　　 荧光素酶报告基因检测用于研究PCBP2和FHL3之间的联系。胶质瘤细胞U251被wt或mt和si-PCBP2或si-NC质粒共转染。在FHL3-wt转染的细胞中，PCBP2敲低后，相对荧光素酶活性显着降低。然而，在PCBP2沉默后，经FHL3-mt转染的细胞中的萤光素酶活性未显示明显变化。所有数据揭示了PCBP2和FHL3之间的目标关系。FHL3靶结合位点的核苷酸序列和核心识别序列为红色。pLV-FHL3载体旨在增强FHL3在神经胶质瘤细胞中的表达。胶质瘤细胞系U251在体外被pLV‐FHL3和相应的对照转染。使用qRT-PCR方法研究PCBP2和FHL3在转染细胞中的相对表达。pLV-FHL3转染后，FHL3mRNA的表达显着增加，而PCBP2表达没有表现出明显的变化。pLV‐FHL3转染后还显示了蛋白质印迹分析的结果，FHL3蛋白的表达显着增加，而PCBP2的表达没有显着变化。因此，PCBP2可以抑制FHL3表达，而FHL3不影响PCBP2表达。数据表明FHL3位于PCBP2。FHL3可能是神经胶质瘤中PCBP2的潜在靶基因。
　　 为了探讨神经胶质瘤进展中PCBP2的分子机制，U251被si-PCBP2和si-FHL3共转染。Western印迹分析表明，与仅通过si-PCBP2转染的神经胶质瘤细胞相比，si-PCBP2和si-FHL3的共转染可显着增强TGF-B1，p-Smad2和p-Smad7蛋白的表达，提示其活化TGF-B/Smad信号通路。此外，增殖中，迁移和侵袭共转染的细胞的能力是明显增强，并且细胞凋亡减少。所有数据均表明，si-FHL3转染可逆转神经胶质瘤中PCBP2敲低引起的抗肿瘤作用。在这项研究中，还进行了动物实验，以验证PCBP2在神经胶质瘤进展中的作用。结果显示，与si-NC转染组相比，被si-PCBP2转染的胶质瘤细胞裸鼠的肿瘤体积和重量显着降低。同时，在体内实验中，si-PCBP2组的FHL3表达水平显着上调。因此，PCBP2可以通过靶向FHL3来调节神经胶质瘤的进展。
　　 胶质瘤是一种致命的恶性肿瘤，约占原发性脑癌的80％。为了改善神经胶质瘤的预后，探索胶质瘤肿瘤进展的分子机制至关重要。在当前的研究中，发现PCBP2沉默可以抑制神经胶质瘤细胞的增殖，迁移和侵袭，并在体外促进细胞凋亡。PCBP2可能通过调节FHL3信号通路参与神经胶质瘤的进展。PCBP2是一种可调节RNA加工的RNA结合蛋白。PCBP2的异常表达可能导致基因改变，从而导致人类疾病，例如癌症。在研究中发现与非癌组织和正常细胞相比，神经胶质瘤组织和细胞中PCBP2的表达明显上调。此外，PCBP2的表达升高与脑胶质瘤的肿瘤大小和WHO分期呈正相关。PCBP2的高表达与胶质母细胞瘤患者的晚期肿瘤分期和不良预后密切相关，这可能是胶质母细胞瘤患者的潜在预后生物标志物。PCBP2表达增加可能是神经胶质瘤患者的危险标志，预示着癌症的发展。
　　 鉴于其在RNA加工过程中的功能，PCBP2参与了多个细胞过程，例如细胞增殖，迁移和侵袭以及细胞凋亡。在研究中，进行了体外实验以研究PCBP2对神经胶质瘤细胞生物学行为的影响。当PCBP2表达降低时，转染的神经胶质瘤细胞的细胞生长和运动被显着抑制，细胞凋亡增强。PCBP2的上调可以显着促进体外胶质瘤细胞的增殖和生长。建议PCBP2可以促进神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。这些先前的研究均支持研究得出的结论。PCBP2可能是神经胶质瘤的癌基因和治疗靶标。还研究了神经胶质瘤进展中PCBP2的分子机制。敲除PCBP2可能导致神经胶质瘤细胞中FHL3的高表达和TGF-B/Smad信号通路的低活性。此外，FHL3的表达没有明显影响PCBP2的表达。因此，FHL3可能是神经胶质瘤中PCBP2的下游靶基因。此外，体内小鼠实验也验证了出国看病服务机构研究的结果。也表明了PCBP2和FHL3在神经胶质瘤进展中的联系。PCBP2可能结合FHL3基因的3'UTR。与疾病中的几种靶基因结合。PCBP2可以通过直接3'UTR结合调节胃癌患者的CDK2，这可能被用作治疗胃癌的潜在生物标志物。PCBP2可通过稳定STAT1和STAT2的mRNA来增强IFN-α对HCV的抗病毒活性。此外发现抑制FHL3这种表达可能增强了被siPCBP2转染的神经胶质瘤细胞的TGF-B/Smad信号通路活性。FHL3蛋白属于仅LIM蛋白家族，可以增强Smad蛋白的磷酸化和不清楚的积累，从而导致肿瘤抑制因子p21的激活和癌基因c-myc的抑制。在当前的研究中，出国看病服务机构还发现敲除FHL3可以逆转神经胶质瘤中PCBP2沉默表达所引起的肿瘤抑制作用。因此，PCBP2可能通过抑制FHL3激活TGF-B/Smad信号通路，从而促进神经胶质瘤的发展。
　　 当然，应该指出当前研究的一些局限性。首先，样本量相对较小，可能会降低当前研究的统计能力。其次，本研究未研究PCBP2与其他基因之间的相互作用以及可能在癌症发展中发挥潜在作用的相对信号通路。胶质瘤的进展是由各种基因，非编码RNA，途径和蛋白质组成的网络调节的复杂过程。为了解释神经胶质瘤的发展和进展，需要进一步的研究来探索神经胶质瘤的遗传调控网络。总之，PCBP2的表达上调可促进神经胶质瘤的进展，包括增强细胞增殖，迁移和侵袭，以及抑制细胞凋亡。在神经胶质瘤中，PCBP2通过靶向FHL3参与神经胶质瘤的发展来激活TGF-B/Smad信号通路。