胶质母细胞瘤是常见恶性原发性脑肿瘤，预后较差，总生存期为18个月。肿瘤进展是一个复杂的过程，涉及基因组突变，微环境因子和免疫炎性调节剂，涉及多种胶质瘤细胞分泌的蛋白酶，包括基质金属蛋白酶。研究人员记录了毫米Ps的表达或活性水平与胶质瘤细胞的生长和侵袭之间的直接相关性。炎症在神经胶质瘤的生长中起关键作用。神经胶质瘤释放炎性介质，包括肿瘤坏死因子-a，后者是炎症的主要调节剂之一。GBM中多种促炎细胞因子-1B，IL-6，IL-10和TNF-a）的表达明显较高，并且与它们的进展和临床侵袭性密切相关。TNF-a和IL-1B激活IL-6和IL-8的产生，而这些促癌介质可以促进GBM的生长。此外，出国看病网研究人员先前的研究强调了IL-1B在胶质瘤细胞侵袭中的作用。
　　 胶质瘤侵袭过程中涉及多种因素，这需要促炎性细胞因子以及主要的信号传递中心，如核因子κB和促分裂原激活的蛋白激酶信号传递。这些因素动态地起作用并调节神经胶质瘤细胞的侵袭性。信号枢纽通过促进炎症和免疫反应来响应多种细胞外信号。最近，在急性淋巴白血病中，也有人提出可能涉及信号转导子和转录激活子6。在大多数的神经胶质瘤中，RA途径被激活。在源自LN443和U373神经胶质瘤细胞系的恶性神经胶质瘤中，磷酸化的细胞外信号调节激酶升高。Rictor雷帕霉素不敏感复合物的核心成分敲低可通过Raf1-MEK-ERK信号传导增加毫米P-9活性和LN18胶质瘤细胞的侵袭。但是，TNF-a微环境在MEK途径中的作用以及可能在胶质瘤浸润中的其他相关信号转导子的作用仍远未阐明。了解促炎环境中神经胶质瘤侵袭的机制至关重要。在40％的GBM肿瘤中发现p53是突变型。U87MG细胞表达野生型p53，而U251MG细胞表达突变型p53。最近有报告指出，使用患者来源的细胞可能在衍生神经胶质瘤入侵的体外模型中起重要作用，这使其具有临床意义。从这个角度出发，本研究旨在将这两种细胞类型和患者来源的GBM细胞整合在一起，以研究TNF-a对细胞生存力，侵袭及其对毫米Ps的影响，MEK–ERK信号传导以及某些信号蛋白。
　　 U87MG胶质瘤细胞系从印度国家细胞科学中心购买，U251MG胶质瘤细胞系由P.Kondaiah教授友善提供。根据临床诊断和神经影像学，在印度班加罗尔NIMHANS神经外科的手术室进行手术期间，收集了人类高级神经胶质瘤肿瘤样品。根据NIMHANS研究所伦理委员会批准的方案，在收集肿瘤样品之前已获得患者的知情同意。所获得的患者来源的神经胶质瘤肿瘤样本是由神经病理学家诊断的；一个样品为间变性少突胶质细胞瘤，另一个样品为胶质母细胞瘤。通过使用Dulbecco改良的Eagle's中高葡萄糖和20％胎牛血清处理这些高级神经胶质瘤肿瘤样品获得原代培养细胞。将U87MG和U251MG细胞系保存在补充有10％FBS和百分之一　PenStrep的DMEM中。将细胞在含5％CO的潮湿气氛中于37摄氏度孵育s中高葡萄糖与20％胎牛血清和百分之一　PenStrep进行贴壁细胞培养。这些细胞传代了5-10代。将U87MG和U251MG细胞系保存在补充有10％FBS和百分之一　PenStrep的DMEM中。按照制造商的说明将TNF-a重悬于无菌水中，并在无血清DMEM中进行工作稀释。将U0126和PD98059溶解在二甲基亚砜中。U0126-5mg。PD98059-10mg。将3--2-，5-二苯基四唑溴化物重悬于DMEM中。
　　 胶质瘤细胞的生存力通过MTT测定法评估。TNF-a刺激神经胶质瘤细胞。24小时后，加入DMEM培养基中的MTT试剂并孵育4小时。用微板分光光度计在570nm处测量吸光度。显示的数据代表三个独立的实验。胶质瘤细胞的侵袭通过体外transwellMatrigel侵袭试验进行了研究。将细胞添加到上室并在有TNF-a的条件下孵育24小时，下室包含标准培养基，其中含有10％FBS作为趋化因子。固定侵入的细胞，并用结晶紫染色。使用倒置显微镜在膜的五个随机视野中计数染色的细胞。通过处理前的神经胶质瘤细胞与MEK-ERK抑制剂30分钟。明胶酶谱分析法证实了毫米Ps的明胶酶亚家族的活性。简而言之，处理24小时后收集条件培养基。凝胶用0.25％考马斯亮蓝染色并拍照对于光密度分析，使用了ImageJv1.47。
　　 使用TRIzol试剂从神经胶质瘤细胞中提取RNA，并使用制造商的说明通过EasyScriptRTase进行逆转录。使用2xPCRTaq‐MasterMix按照制造商的说明使用200nM每种基因特异性引物进行PCR。将反应混合物在94摄氏度下预变性5分钟，然后在94摄氏度下预变性30s，然后在57摄氏度或61摄氏度或61.9摄氏度变性30s，最后在72摄氏度30s持续30个循环。用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，并用Bradford方法定量。将蛋白质提取物溶解在10％SDS-PAGE中，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后将膜在PBST的5％脱脂牛奶中封闭，并与一抗在4摄氏度下孵育过夜。接下来，洗涤膜并与二抗一起孵育。印迹用ECL系统显影。ERK-1，ERK-2，NF-κB1和STAT-6兔多克隆抗体和山羊抗兔抗体是用于评估蛋白质。显示的数据代表三个单独的实验。数据表示为使用GraphPadPrism6.0分析的三个独立实验获得的结果的平均值和标准偏差。确认满足正态性假设后，统计分析包括两尾，不成对的Studentt检验或方差单向分析，并进行多重比较，然后进行Dunnett检验。P小于0.05值被认为是显着的。
　　 为了评估TNF-a对神经胶质瘤细胞活力的影响，用浓度不断增加的TNF-a刺激U87MG和U251MG细胞，并通过MTT分析证实了细胞活力。在使用任何浓度的任何一种细胞系中，均未观察到对细胞活力的任何显着影响。表明在这些浓度下，TNF-a对这些细胞系没有任何细胞毒性作用。为了进一步研究，使用了最低浓度的TNF-a。在两个患者来源的原发性神经胶质瘤细胞样本中评估了TNF-a的作用，但是，对这些细胞的细胞存活率没有显着影响。为了检查TNF-a对神经胶质瘤侵袭的影响，用TNF-a刺激U87MG，U251MG和患者来源的原发性神经胶质瘤细胞。通过体外基质胶侵袭试验研究了TNF-a介导的侵袭。与DMEM处理的对照相比，TNF-a显着增加了这些神经胶质瘤细胞的侵袭。为了评估TNF-a对毫米Ps明胶酶亚家族活性的影响，用TNF-a刺激U251MG，U87MG和患者来源的原发性神经胶质瘤细胞24小时明胶酶谱法证实了毫米P-2和毫米P-9的活性。出国看病网研究人员观察到，与DMEM处理的对照相比，TNF-a增加了U251MG细胞的毫米P-2活性，但毫米P-9活性没有变化。而在U87MG，HGP19和HGP20胶质瘤细胞，与DMEM处理的对照组相比，没有观察到毫米P-2和毫米P-9的活性增加。接下来检查了U251MG和U87MG细胞中这两个毫米P的信使RNA表达。U251MG和U87MG细胞中毫米P-2和毫米P-9的mRNA表达没有变化。
　　 为了描述MEK–ERK参与TNF-a诱导的侵袭性，用MEK–ERK抑制剂U0126和PD98059结合或不结合TNF-a。与对照组相比，TNF-a显着增加了U87MG细胞的侵袭性。U0126和PD98059减弱了TNF-a诱导的U87MG细胞的侵袭。检测了存在或不存在ERK抑制剂PD98059的TNF-a下U87MG细胞中ERK-2的表达，以及p-ERK的水平。用TNF-a刺激细胞，并通过蛋白质印迹分析蛋白质表达。与对照相比，TNF-a增加ERK-2的表达并增加p-ERK的水平。重要的是，ERK抑制剂减弱了TNF-a诱导的表达增加。此外，为了评估TNF-a对U87MG神经胶质瘤细胞中NF-κB，STAT-6，ERK-1和ERK-2表达的影响，分别用TNF-a和通过蛋白质印迹分析蛋白质表达。与DMEM处理的对照相比，TNF-a显着增加了所有这些蛋白质的表达。
　　 炎症是肿瘤进展的关键组成部分，它支持恶性表型。肿瘤和周围细胞在与肿瘤相关的炎症中分泌一些分子，从而形成了一种有助于癌症的肿瘤微环境。TNF-a是主要的促炎细胞因子，以自分泌和旁分泌方式参与小胶质细胞的活化和随后的肿瘤微环境。入侵是癌细胞与周围微环境之间持续相互作用的结果。当前研究中提供的实验数据证明TNF-a增强U87MG和U251MG细胞的侵袭。TNF-a具有在这些神经胶质瘤细胞对细胞活力没有影响，因此，TNF-a的微环境和神经胶质瘤细胞侵袭之间的结合是没有对这些细胞的任何细胞毒性作用。细胞外基质的降解是参与肿瘤侵袭的常见因素。毫米Ps在胶质瘤的侵袭作用中起着至关重要的作用。在毫米P家族中，由于毫米P的明胶酶亚家族在恶性神经胶质瘤的病理生理中具有相关意义，因此被广泛研究。因此，研究了TNF-a刺激对这些神经胶质瘤细胞中毫米P-2和毫米P-9活性及表达的影响。结果表明，在U251MG胶质瘤细胞中TNF-a刺激后，毫米P-2的活性显着增加，但毫米P-9却没有。相反，TNF-a对U87MG和原发性神经胶质瘤细胞中毫米P-2或毫米P-9的活性没有任何影响。出国看病网研究人员没有观察到U251MG和U87MG细胞中毫米P-2和毫米P-9的相应mRNA表达有任何改变。由于没有注意到毫米P-2的mRNA表达发生任何变化，因此TNF-a可能通过其细胞表达增加以外的机制来调节U251MG细胞中的毫米P-2活性。似乎在TNF-a微环境中对毫米P-2活性的调节是细胞特异性的。以前关于T98G胶质瘤细胞中毫米P-1和毫米P-3表达上调的报道，但并未上调毫米P-2和毫米P-9的报道以及活性没有升高。在LN18胶质瘤细胞中表达，而在DU145前列腺癌细胞中毫米P-2活性上调而不是毫米P-2蛋白表达上调赞同相同的观点。TNF-a显着增加了患者源性神经胶质瘤细胞的两种原代培养的侵袭性，而对细胞活力没有任何影响。
　　 靶向胶质瘤中ERK信号传导途径的治疗兴趣的高涨反映了其明显的意义。一项较早的研究报道，在TNF-a介导的炎症反应的U251细胞中，p38MAPK而非ERK信号传导起着重要作用。U0126对MEK–ERK的抑制作用显着阻止了U87MG细胞的生长并对其进行放射增敏，而在常氧和低氧条件下，这些作用在U251MG细胞中几乎没有受到影响。因此，为了破译参与TNF-a介导的侵袭的机制，研究了TNF-a在ERK信号传导中调控U87MG细胞胶质瘤微环境的复杂作用。用MEK–ERK抑制剂U0126和PD98059进行的实验观察表明，TNF-a刺激介导的侵袭具有明显的衰减作用。这一结果表明，MEK–ERK信号通路对U87MG细胞中TNF-a介导的神经胶质瘤细胞的入侵有重要贡献。为了进一步描述机制，评估了在存在或不存在MEK-ERK抑制剂PD98059的TNF-a下，U87MG细胞中ERK-2的蛋白表达及随后的p-ERK水平。TNF-a上调ERK-2的表达以及p-ERK的水平，而ERK抑制剂可明显降低该表达。因此，从有效抑制ERK表达和p-ERK水平骤降，同时通过实验性抑制剂相应抑制基质胶侵袭的证据来看，可以推测MEK-ERK信号传导在TNF-a诱导的胶质瘤细胞侵袭中的意义。
　　 TNF-a超家族蛋白和TNF-a诱导的蛋白2和6已被纳入具有肿瘤预后意义的肿瘤微环境相关基因中。TNF-a介导的信号传导的重要性。另外，还表明ERK途径对T98G细胞中的NF-κB具有调节作用。反映GBM表型的恶性特征的形成是由相对较少的主要信号枢纽决定的。在这些NF-κB途径中，该途径通过激活转录因子来应答信号，所述转录因子可以串扰并介导炎症和免疫反应，据报道在神经胶质瘤中被持续激活。NF-κBp65参与了U251MG细胞的侵袭，但是，尚不清楚NF-κB活化的确切机制及其在神经胶质瘤生长中的作用。NF-κB活性已在许多癌症中得到增强，这主要归因于上游信号通路的调控改变。最近，各种模型中的各种工作明确强调了信号传递介质网络对各种应激反应系统的重要性，其中除了TNF-a，NF-κB和ERK的联系外，还加入了STAT-6。尽管STAT-6被证明在GBM的侵袭中起作用，但STAT-6在U251MG细胞中不表达，而STAT-6蛋白在U87MG细胞中表达很强。在HEK293细胞中，TNF-a激活的基因在转录水平上以STAT-6依赖性方式表达，并通过激活诱导的NF-κB蛋白与STAT-6元素的结合而介导。因此，考虑到这些信号传导效应因子与TNF-a之间可能存在联系，评估了TNF-a诱导的促炎性微环境中NF-κB和STAT-6的表达。TNF-a在U87MG细胞中除了ERK-1和ERK-2以外，还上调了NF-κB1和STAT-6的表达。有证据表明，STAT-6靶基因可能需要其他前侵袭因子才能进行侵袭。在这种情况下，MEK-ERK信号可能参与了TNF-a诱导的促炎性微环境中U87MG胶质瘤细胞的侵袭，并伴有NF-κB，STAT-6的过度表达。除了ERK-1和ERK-2之外，这些信号中心之间的投机性错综复杂的相互作用也为线索提供了线索，这些信号中心是TNF-a介导的入侵的必要前侵袭性效应子。
　　 本研究强调了在TNF-a诱导的促炎环境中神经胶质瘤细胞入侵的可能原理，这涉及MEK-ERK信号的直接作用，可能涉及NF-κB，而STAT-6则需要进一步研究。深入研究以建立这些信号传导效应因子之间的精确相互作用，从而深入了解GBM侵袭性的病理生理。如果成功解密，可能会打开巨大的治疗翻译潜力。