基于分子特征的神经胶质瘤分类在神经胶质瘤的诊断和治疗中起着越来越重要的作用。遗传，DNA甲基化，基因表达特征已被证明影响胶质瘤患者预后和相关分子标签，如异柠檬酸脱氢酶基因1和2状态，O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶启动子状态，染色体臂1p和19q的编码以及TERT启动子状态已广泛用于预后预测。先前有关神经胶质瘤分类的研究有助于预测预后和指导治疗方案，例如癌症基因组图谱报告的神经胶质瘤的转录分类定义了4种亚型，经典，间充质，神经，和原神经，所知胶质瘤诊断和治疗改善。然而神经胶质瘤仍然是对患者的严重威胁，尤其是最具侵袭性的胶质母细胞瘤。由于缺乏有效的治疗方法，GBM患者的中位生存期仅为目前标准治疗后的14.6个月。专注于一种新颖的方法，即根据替代剪接事件概况对神经胶质瘤进行分类，以更全面地了解神经胶质瘤并探索其诊断和治疗的新思路。
　　 AS是一个动态过程，发生在基因转录成前体mRNA后，并导致转录组变得复杂。剪接模式的变化会影响蛋白质的结构和功能。AS在肿瘤发生中起关键作用。癌症特异的mRNA转录物可能导致肿瘤抑制子功能丧失或癌基因和癌症通路的激活。最近，一项研究综合分析来自TCGA数据集的不同肿瘤类型，以结合蛋白质组学分析来检测肿瘤特异性AS。这项研究提出一种探索肽作为肿瘤免疫疗法中潜在抗原的新方法。除了鉴定肿瘤特异性AS外，AS对癌症进展，特别是与预后相关的AS的生物学作用也值得关注。综合分析非小细胞肺癌，大肠癌和食道癌揭示AS的预后意义。ANXA7，MARK4，MAX，USP5，WWOX，BIN，RON，和CCND1的AS据报道，影响神经胶质瘤的关键生物学功能，导致改变的预后;但尚未对神经胶质瘤剪接模式进行系统分析。基于TCGARNA-seq数据的可用性，对神经胶质瘤患者预后相关的剪接事件进行了全面分析。此外，基于与预后有关的剪接事件，出国看病网研究人员确定了具有不同剪接特征和临床特征的新型胶质瘤分类，为胶质瘤研究的新思路提供了启示。
　　 从TCGA的数据门户获取了665个神经胶质瘤样品的RNA-seq数据和相应的临床数据。Bioconductor程序包TCGAbiolinks。通过使用TCGASpliceSeq下载上述样本中的拼接事件百分比值，这是一个基于网络的平台，可提供TCGA肿瘤的剪接模式。在此平台上，剪接事件分为7类，包括外显子跳过，保留内含子，替代启动子，替代终止子，替代供体位点，替代受体位点，以及互斥外显子。在GBM数据集中总共检测到83,776个剪接事件，包括47,672ES，3574RI，12425AP，9210AT，4910AD，5630AA和355ME。在LGG数据集中共检测到96,419个剪接事件，包括58,503ES，3694RI，13183AP，9366AT，5260AD，5954AA和458ME。根据每个剪接事件的平均截止PSI将患者分为两组。为了进行进一步的聚类分析，这是确保数据不为零并排除异常值影响的剪接事件所必需的，包括满足以下条件的剪接事件：1）任何样品均不丢失PSI值；和2）每个组的样本量为总大小。泛神经胶质瘤样本中有16,173个事件与GBM样本中有20,939个事件相匹配。对数秩检验用于评估总体生存与AS事件之间的关系。用p拼接事件对数秩检验中的-值小于0.01被认为是预后的。同样的策略在进一步的研究，包括拼接分组和剪接因子生存分析进行，如在出国看病网研究人员以前的研究描述。
　　 对所有神经胶质瘤样本以及GBM样本均进行了与预后相关的剪接事件的聚类分析。蒙特卡洛共识聚类是一种基于共识聚类且带有假设测试框架的算法，用于出国看病网研究人员的聚类研究。M3C的R软件包可从Bioconductor下载。为了评估最佳子组数，综合考虑了以下指标：累积分布函数，经验p值，模糊聚类比例和相对聚类稳定性指标。出国看病网研究人员使用类似于MicheleCeccarelli报道的策略，评估了整个剪接簇的DNA甲基化水平。如果每个亚型的剪接事件的平均PSI值比任何其他亚型的剪接事件高30％，则将其视为签名。使用Mann-WhitneyU检验进行统计分析。使用R包Scales将每个剪接事件的PSI值转换为0到1的比例。随后，转换后的值将显示在热图中。选择在癌症中具有公认的预后意义的剪接因子，尤其是在神经胶质瘤和pST1特异性剪接事件中，进行分析。Spearman相关测试用于评估剪接因子的表达水平与pST1特异性剪接事件的PSI值之间的关联。系数大于0.45和p值小于0.05的相关被认为是重要的，并显示在网络图中。Cytoscape用于构建关系网络。平均PSI值超过组间差异两倍的预后剪接事件被认为是IDH状态相关的剪接事件。使用Mann-WhitneyU检验进行统计分析。使用R包Scales将每个剪接事件的PSI值转换为0到1的比例。随后，转换后的值将显示在热图中。
　　 深入分析了TCGA的154个GBM患者和511个LGG患者的剪接事件概况。进行单变量生存测试以评估剪接事件的PSI与OS之间的相关性。首先，为了搜索泛神经胶质瘤样本中的预后剪接事件，出国看病网研究人员结合了GBM和LGG数据集并进行了全面的生存分析；确定了10,370个具有预后意义的剪接事件，包括2611ES，693RI，1378AP，4456AT，568AD，632AA和32ME。分析表明，GBM和LGG之间的剪接模式存在很大差异。然后仅对GBM进行生存分析。共有1038个剪接事件随后检测为与GBM患者存活显著相关联，包括344个ES，45RI，164AP，322AT，AD85，77AA和1ME。共有551个剪接事件都参与了两个泛神经胶质瘤和GBM预后。在整个神经胶质瘤样本的每个剪接类别中，超过50％的剪接事件是预后的，而在GBM样本的每种剪接类别中，不到7％的剪接事件是预后的。为了分离泛神经胶质瘤样本中的剪接亚型，对665个神经胶质瘤样本进行了与预后相关的剪接事件的M3C分析。聚类稳定性最好在k=2或7。不论k=2还是k=7，神经胶质瘤等级是主要分布在不同簇中的GBM和LGG样品的主要判别指标，表明基于出国看病网研究人员的标准的聚类与神经胶质瘤的临床分类是一致的，并表明剪接图谱GBM和LGG之间的区别。为了探究LGG的内在特征，进一步分析k=7的神经胶质瘤剪接类型，标记为pST1-7，其中包含153、54、173、94、20、74和97个样本，分别。在分析中基于pST1-7签名的主成分分析也显示出GBM和LGG样品之间存在显着差异。如前所述，pST1仅来自GBM数据集，几乎包括所有GBM样本。除了来自GBM的一个pST3样本外，其他六个聚类几乎全部来自LGG。
　　 为了确定每个簇的临床特征和分子特征，分析了来自TCGA的每个样品的临床数据，并确定了胶质瘤的关键分子指标。DNA甲基化谱图也被证明与神经胶质瘤的分类有关。为了确定DNA甲基化谱图和AS谱图之间的关系，对TCGASpliceSeq和TCGA甲基化平台中的数据进行了综合分析。pST2-7具有独特的临床和分子特征；在这些类型中，pST2的特征是显着的。与pST3-7相比，pST2包含更高比例的III级神经胶质瘤和更高比例的星形细胞瘤。在临床上，PST2类似于PST1或GBM，具有较高的诊断年龄和预后不良。pST2还具有与pST1或GBM相似的特征，并具有IDH野生型的分子富集，1p/19q非编码缺失，未甲基化MGMT启动子，7号染色体增益与10号染色体缺失配对，染色体19/20增益中。另外，与pST3-7相比，pST1-2显示了全基因组的低甲基化。总体而言，尽管pST2样本全部来自LGG数据集，但该组的恶性表型与GBM相似。组织学分析表明，与pST2不同，pST7携带少突胶质细胞瘤。此外，pST7患者的临床预后较好，其分子表型预后良好。pST7富含IDH突变，1p/19q共缺失和MGMT启动子甲基化％，p小于0.01），且其与怀有染色体10损耗或染色体19/20增益中。
　　 随后，发现与已公开的神经胶质瘤分类相关的新型剪接簇，以转录组亚型为例，大多数pST1-2样本为CL或MES，而pST6主要是NE和PST3，4，5，7，主要是PN相比，观察到了明显的分布趋势：92.6％pST1-2样品被分为LGm4-6。而90.2％pST3-7样本分成LGm1-3，这是基因组范围的超甲基化中。对基因组学，RNA表观遗传学或蛋白质组学的神经胶质瘤分类分析已经发表。在研究中，还进行了基于AS的分类。实际上分类之间的相关性很普遍，表明临床现象可能与不同水平的多种分子特征有关。全面使用这些分类可能更可靠。
　　 根据数据，与LGG相比，GBM具有独特的基因型和表型以及不同的剪接模式。此外，GBM由于其不良结局和难治性而需要更积极的治疗。在GBM异质性被认为是有助于治疗的抗性。通过使用单细胞RNA-SEQ技术，这是近年来发展迅速，在GBM肿瘤内异质性被确定在单细胞水平。为了揭示在GBM的异质性，并提供根据分子表型更针对GBM诊断和治疗，GBM分类的建议一直是标准方法。但尚未探索基于AS的GBM的分类。使用用于泛神经胶质瘤分类的相同策略，仅对GBM进行了分类研究。为154个GBM样品的预后相关的剪接型材蒙特卡洛一致性的聚类确定了三个健壮聚类，标记的ST1-3，以在CDF情节最平坦曲线，最低p-值和弯头在PAC乐谱曲线和RCSI曲线在k=3时。ST1，ST2和ST3分别包含49、49和56个样本。在进一步的分析还进行基于ST1-3的签名PCA来显示3种剪接类型GBM样品。为了确定每个簇的分子特征，还分析GBM的几种公认的分子指标，包括IDH状态，CpG岛甲基化子表型和MGMT启动子状态。总共在所有GBM样本中观察到6.8％IDH突变，并且在三个剪接簇之间有所不同。IDH突变在ST3中最常见，在ST1中没有IDH突变，在ST2中发生6.3％的频率。与IDH状态和脑胶质瘤CIMP之间的关联一致，ST1仅是非G-CIMP，而G-CIMP样品富含ST2和ST3/56，10.7％）。MGMT启动子状态在三个集群中也有所不同。在ST3中观察到的MGMT启动子甲基化样品比例高于ST1或ST2。
　　 为了进一步阐明基于存活相关剪接事件的这种新分类的临床意义，分析TCGA患者的临床数据。与以前的GBM转录组分类最一致的临床关系是年龄，在前神经分类中年轻患者的比例明显更高。相比之下，GBM剪接亚型与诊断时的中位年龄没有显着相关，但ST1中年轻患者的比例小于非ST1，10.5％）。与ST2患者和ST3患者相比，ST1患者的中位生存时间明显缩短。尽管差异无统计学意义，但ST3患者的无病生存期比ST1患者和ST2患者更长。为了评估标准化治疗对这3个组的影响，检查TCGA数据并比较了接受标准化治疗的患者的生存期。标准治疗显着改善了ST3簇的预后，但并未改变ST1和ST2簇的生存率。此外将分类与GBM以前的转录亚型进行了比较，出国看病网研究人员发现ST1样本主要分布在MES中，而很少分布在PN。还对通过拼接配置文件进行聚类和通过先前报告的分类进行聚类进行了其他比较，以显示这些分类之间的关系。综上所述，基于ASM预后的GBM聚类分析定义3种亚型：ST1的临床结局最差，预后不良的分子特征，ST3的临床结局，治疗敏感性和预后良好的分子特征均最佳，ST2的临床预后不良。其他2个亚型之间的分子特征。
　　 为了对外部神经胶质瘤样品进行分类，研究亚型特异性剪接特征。识别仅在一种亚型中增加的剪接事件并将其定义为每种亚型的特征。产生热图总共1175个剪接签名在泛胶质瘤每种亚型。每个簇中的代表性剪接签名也以方框图的形式显示，包括ZNF283，POLR2F，LSM5，ZNF771，AKT3，GLS和LDHA。发现POLR2L是RNA聚合酶II的一个亚基，是预后的剪接因子，其AS也可预后于肺癌。在这还发现RNA聚合酶II的另一个亚基POLR2L，其AS是pST2中重要的预后标志，可能有助于低度神经胶质瘤的恶性表型。pST3中特别上调另一个剪接因子LSM5的AS。AKT3的AS报癌症中发挥重要作用和AKT3表达参与胶质瘤的进展。AKT3的AS是pST5的剪接标记，这可能进一步揭示AKT3在神经胶质瘤中的作用。GLS和LDHA是参与IDH突变胶质瘤生物学进展代谢酶;GLS和LDHA的AS在神经胶质瘤中的作用尚不清楚。GLS和LDHA的AS分别是预后最好的聚类pST6和pST7的标志，这表明代谢酶的表达和AS可能与IDH突变型神经胶质瘤有关。进行相同的策略以确定在GBM亚型81剪接签名和绘制热图。三个代表剪接签名也显示在箱形图中。DHRS4L2是脱氢酶还原酶家族的成员，在神经母细胞瘤中表达特定的替代转录本。DHRS4L2的AS也可能参与GBM的恶性进展，因为它的ST1明显增加。在ST2中，FAM13A的AS是肺癌的关键调节剂被发现为拼接签名。RPL39L报告为在癌症中具有上调表达核糖体蛋白以及耐药性发挥了作用。RPL39L的上调AS在ST3中观察到，RPL39L的AS的PSI值呈负RPL39L的mRNA表达水平相关。这些发现可能表明RPL39L的AS诱导mRNA表达下调，从而导致对GBM中同时治疗的敏感性。
　　 剪接因子表达水平的变化通过调节AS显着影响多种肿瘤的发生和发展。越来越多的证据表明，剪接因子改变触发的RNA加工会影响神经胶质瘤的预后。为了阐明神经胶质瘤的预后性AS调控过程，表征pST1特异性剪接事件的调控网络，这表示神经胶质瘤中不利的预后剪接特征。在这里集中于肿瘤，尤其是神经胶质瘤中公认的预后剪接因子，并通过使用TCGARNA-seq表达数据进行生存分析，确定它们对神经胶质瘤的预后效果。剪接因子包括癌症启动子和癌症抑制器用于进一步的相关性分析。相关性，并给出了由其基因符号表示的129个pST1特异性剪接事件。令人惊讶地，这些pST1特异性剪接事件都与与不良预后相关的剪接因子的表达成正，与与良好预后相关的剪接因子的表达成负相关。同时，还发现上述剪接因子的表达水平在剪接簇之间是不同的，这表明剪接因子在神经胶质瘤的剪接谱中起重要作用。
　　 最近研究表明，SNRPB是剪接体复合体SmB/B'的关键元素，是GBM中重要的致癌剪接因子，有助于调节RNA加工，DNA修复和染色质重塑。与该发现一致，剪接因子和pST1特异性剪接事件的调控网络显示SNRPB是与重要的pST1特异性剪接事件呈正相关的中枢不利的预后剪接因子。CELF2，神经胶质瘤进展中，报告作为许多的AS跨固体癌样品事件的重要调节剂和表现出与PST1特异性剪接事件，表明其通过调节许多剪接事件在胶质瘤抑制中的关键作用。KIF4A和FKBP11的AS的AS是此网络用神经胶质瘤预后重要剪接预测。显示KIF4A外显子32的SNRPB和AT之间的表达以及FKBP11外显子8的CELF2和AT之间的显着相关。IDH状态是胶质瘤患者预后的最重要指标，并且是转录组/甲基化组/fCNV胶质瘤分类的主要驱动力。在泛神经胶质瘤剪接分类中，除了肿瘤等级以外，IDH状态也是剪接聚类的重要判别指标。pST1-2剪接亚组包含IDH野生型样品，而pST3-7剪接亚组包含IDH突变。为了确定与IDH状态相关的预后剪接事件，将样本分为IDH野生型/突变组。剪接事件，平均PSI值超出被选择两次组之间的差异进行观察，以及总共840个剪接事件。
　　 虽然蛋白质组学研究表明，大量基因的有一个主要的蛋白同种型，越来越多的证据表明从选择性剪接得到的该蛋白质的复杂性在癌症进展发挥至关重要的作用。AS可能会诱导蛋白质中功能域的插入，缺失或取代，从而导致细胞功能改变。为了进一步预测神经胶质瘤患者预后中涉及的编码蛋白的潜在功能元件，将IDH与状态相关的剪接事件的先前数据与UniProt基因的规范蛋白质产物的数据进行了比对），其中包含已知域的注释。包含ZNF域的锌指蛋白是广泛的蛋白家族，它们有助于各种生物学功能，包括癌症进展。Cys2His2是ZNF的第一个被发现和特征最强的类型，具有多种功能，包括序列特异性DNA结合和RNA结合。观察到ZNF的AS与IDH状态有关。AS的类型基本上是AT，替代的外显子是ZNF结构域，即3端ZNF结构域缺失的改变与IDH状态相关。根据分析结果，在具有IDH突变的样品中发现ZNFs中锌指基序缺失的比例更高，具有pST2-7样品中类似的结果中，证明锌指可能有助于恶性进展在神经胶质瘤。此外，除了具有CXXC型和植物同源域型锌指基序的KDM2B外，这些ZNF中的大多数其他外显子均编码串联C2H2型锌指基序。
　　 这项研究提出了神经胶质瘤预后相关AS的第一个聚类分析。与此相反以基因组，RNA表达谱，表观遗传学或蛋白质组学先前胶质瘤分类分析，研究集中于AS，生物学过程，影响蛋白同种型和功能的多样性。在泛神经胶质瘤和TCGA的GBM样本中系统地鉴定了与生存相关的剪接事件。在整个神经胶质瘤样本中观察到的预后剪接事件比例显着高于GBM样本。此外数据显示GBM和LGG样本之间存在明显差异。对合并的GBM和LGG数据集进行了聚类分析，共确定了7个组。在这项研究中观察到的胶质瘤等级和全胶质瘤剪接分类之间的强关联与基于蛋白质组学的聚类一致。这些结果表明，AS作为影响蛋白质翻译的共转录或转录后过程，可能通过影响组织学表型和肿瘤等级来促进神经胶质瘤的预后。作为唯一的GBM样簇，与其余6个LGG样簇相比，pST1具有独特的剪接特性，为区分神经胶质瘤等级提供了新方法。此外，研究的另一个重要发现是鉴定出pST2，这是一个LGG簇，具有与GBM相似的恶性表型，主要是IDH野生型，这表明基于标志性剪接来区分不良预后的低度胶质瘤的新方法事件。专门针对集群的研究还提供了一种使用AS检测对具有不同表型的神经胶质瘤进行分类的新方法。由于本研究样本有限，因此需要更大的队列进行验证。
　　 使用相同的策略，GBM队列被分为3个ST。在这些类型中ST1被确定为预后最差的最独特亚型，并与公认的恶性表型分子特征相关。先前的GBM分子分类研究发现，前神经分类与较好的预后相关，但不能从积极的治疗中受益。相反，研究表明ST3具有良好的表型，不仅具有最佳的预后，而且具有最强的放化疗敏感性，表明剪接谱可能与转录组无关并影响GBM的生物学行为。研究表明同步放化疗可能对改善ST3患者的预后特别重要，但这种可能性需要进一步的临床数据。基于剪接特征的胶质母细胞瘤或泛神经胶质瘤聚类在识别具有临床上显着预后表型的聚类中具有优势，包括恶性聚类和良性表型和类似pST7LGG的小组。
　　 IDH状态被认为是大多数聚类研究的主要因素，而最近的一项研究揭示IDH状态与剪接事件之间的联系。与此发现一致的数据还表明，基于剪接的预后聚类与IDH状态相关。但IDH状态和AS之间关系的基础机制仍然不清楚。尽管以前的研究揭示在原发性骨髓纤维化剪接突变和IDH状态的相关性，类似的结果未在成胶质细胞瘤观察。ZNFs与IDH的状态有显着的关系，这也与肿瘤的分级有关。在IDH突变或LGG样品中检测到更多ZNF域缺失。有证据表明ZNF结构域的破坏，由于AS在ZNFs导致转录调节功能障碍。此外发现与IDH状态相关的ZNF域缺失的大部分改变都位于3'端，这可能会在mRNA转录物中引入过早终止密码子或无义介导的衰变，从而调节其稳定性。进一步将先前的AS分析与相应的RNA-seq数据进行比对。有趣的是，在某些ZNF中，ZNF域的缺失与mRNA表达水平之间存在负相关关系，这可能表明AS引入了PTC或NMD并导致衰减为mRNA转录。然而，这种现象并非在所有ZNF中都普遍存在，证明胶质瘤中ZNF结构域缺失的潜在机制十分复杂，需要进一步研究。对这些替代ZNF结构域的靶基因的研究可能提供深入了解ZNFs在神经胶质瘤中的重要性。
　　 进一步研究阻断ZNF及其靶基因之间的相互作用可能会揭示克服神经胶质瘤的新策略。对剪接因子和预后剪接事件的调节网络分析显示，这两个因素在神经胶质瘤中有很强的相关性。PTBP1和HNRNPs被认为是重要的剪接因子在神经胶质瘤进展调节各种剪接事件，这也反映在出国看病网研究人员的分析。还发现SNRPB和CELF2作为预后剪接事件的中心剪接因子，表明这些剪接因子可能是神经胶质瘤治疗的潜在靶标。需要进一步研究这些剪接因子的生物学功能及其下游剪接事件。在这项研究中，对神经胶质瘤中的AS进行了综合分析。建立基于AS概况的神经胶质瘤的新分类，其与神经胶质瘤的等级有关。显示剪接因子和预后剪接事件的调控网络；表明包括SNRPB和CELF2在内的中心剪接因子参与了胶质瘤的剪接调控。此外还确定IDH状态相关的剪接事件配置文件。这项研究可能为神经胶质瘤的异质性提供新的思路，并为神经胶质瘤的诊断和治疗提供新的见解。