颅内肿瘤是威胁生命的病理，主要是由于有限的颅骨空间内的浸润性生长。它们相当罕见，约占所有肿瘤的1.5％，成人每年的发病率约为每10万人中30%，但它们会引起很高的发病率和死亡率。根据世界卫生组织的指示，根据脑肿瘤的恶性程度，将其从I级分级为IV级。患有III级和IV级恶性肿瘤的患者通常显示出较短的时间间隔直到复发，并且预后不良。存在几种类型的颅内肿瘤，其起源和流行病学不同。胶质瘤的特征是脑实质内神经胶质细胞的生长不受控制。它们约占所有肿瘤的30％和恶性原发肿瘤的80％。例如，胶质母细胞瘤是最常见的恶性原发性脑肿瘤。原发性脑瘤也起源于脑膜：非恶性脑膜瘤是最常见的原发性肿瘤，占所有脑瘤的三分之一以上。神经鞘瘤由颅神经形成，尽管是良性的，但它们可产生一系列严重症状，具体取决于肿瘤的大小和位置。其他器官的恶性肿瘤转移也可能扩散到大脑并形成继发性脑瘤。
　　 尽管在肿瘤诊断和治疗方面取得了所有进步，但在过去的40年中，由于这些癌症而导致的总死亡率没有发生有意义的变化。一线治疗通常是手术切除。对于无进展生存期和总体生存期而言，尽可能彻底切除肿瘤组织至关重要。肿瘤边界的识别不仅对于实现最大程度的切除非常重要，而且对于保留健康的功能组织也很重要，从而可以保留患者的生活质量。肿瘤边界的识别对于外科医生来说是一个挑战，因为癌细胞通常会扩散浸润周围的脑组织。外科医生通常根据术前影像通过神经导航估计肿瘤的位置。但是，在手术过程中大脑的移位和变形在1cm以内强烈地限制了空间精度。施用5-氨基乙酰丙酸的荧光显微镜被证明可有效检测神经胶质瘤，脑膜瘤和转移灶，但目前仅被批准作为恶性神经胶质瘤手术切除的辅助选择。由于这些原因，本研究集中于快速术中脑肿瘤评估和鉴定技术的发展。几种方法正在推行包括通过共焦扫描显微镜染色活检快速分析或显微镜用紫外线激发表面以及无标记的组织分析集中在离体成像由受激拉曼散射显微镜。它已经表明，SRS允许识别胶质母细胞瘤的体内在动物实验。但是，对SRS内窥镜系统进行原位临床应用的研究仍处于起步阶段。
　　 无标记的非线性多模式内窥镜检查有可能提供快速的术中组织原位分析。与仿真内窥镜GRIN透镜的组合已经打开的可能性在体内随着时间的推移成像在动物模型和内窥镜系统的持续发展是一个关键，进一步铺平道路，为临床转化的方式。因为它可在体内没有光损伤的诱导被施加，它可以在透视可疑组织的原位研究开发用于。基于同时采集相干反斯托克斯拉曼散射，双光子激发荧光和二次谐波的多峰方法，可实现无标签采集信息丰富的图像。CARS使用超短脉冲激光依靠单个分子振动的共振激发。最常见地，通过在2850cm的频率差上调谐激光来记录CARS图像，以便探测CH2基团，从而探测脂质的分布。CARS显微镜启用正常神经结构以及脑肿瘤的定位的可视化边界。内源性的TPEF采集提供了具有细胞，亚细胞器或弹性蛋白相关附加光学对比度。SHG可视化血管的和在正常和肿瘤实质的细胞外基质纤维胶原。因此，基于无标记非线性多峰显微镜的原位组织分类有可能被用作辅助术中工具。但是，可以预见的用于神经外科手术的内窥镜系统的视场在光学上仅限于直径约为250um的圆形区域很难实现自动平铺程序。在如此小的图像中，不可能看到清晰的肿瘤边界，特别是对于诸如神经胶质瘤的浸润性肿瘤。因此，对于将来的临床内窥镜应用而言，重要的是要了解单个FoV图像中包含的形态化学信息是否足以用于肿瘤识别，以及哪些组织特征可用于该目的。
　　 将CARS，TPEF和SHG结合在一起的无标记非线性多峰成像技术应用于从切除的活组织检查中获得的原发性和继发性人脑肿瘤的冷冻切片。目的是确定典型特征，这些特征在单张图像中清晰可辨，其尺寸类似于内窥镜系统的FoV，并使肿瘤组织与相邻的脑实质分离。研究了良性和恶性初级神经胶质肿瘤，低度恶性脑膜瘤，肺癌，乳腺癌和肾癌的脑转移的冷冻切片，以及黑色素瘤，其是脑癌的最常见的类型。还分析了良性神经鞘瘤，这是最常见的颅神经瘤。此外，直接对切除的样品进行成像，而无需进行任何组织处理或切片，以研究在冷冻切片上获得的结果与更接近人脑肿瘤原位成像的实验条件之间的可转移性。
　　 从25例患有原发性肿瘤的患者中获取肿瘤样本：胶质母细胞瘤，高级神经胶质瘤，低度神经胶质瘤，脑膜瘤，神经鞘瘤，每种肿瘤类型有5名患者，黑素瘤，乳腺癌，肺癌和肾癌的20例脑转移患者，每种肿瘤类型有5名患者。有关患者的详细信息以及肿瘤活检的组织病理学分级。供参考的非肿瘤脑组织来自人类海马和颞叶，用于治疗耐药性癫痫和尸检。人周围神经用作正常周围神经组织结构的参考。在没有任何组织准备的情况下，在切除后的30分钟内对组织活检进行分析，或者将其在液氮中速冻，并在-80°C下保存以制备冷冻切片。将冷冻样品包埋在组织冷冻培养基中，并在载玻片上制备16um厚度的冷冻切片。通过无标记的非线性多峰显微镜对切片进行分析，并对连续切片进行标准苏木精和曙红染色。将切片在-20°C下于甲醇-丙酮中固定10分钟，在水洗液中洗涤，然后在苏木精中孵育3分钟。用水洗涤后，将组织在HCl-乙醇溶液中短暂染色。洗涤5分钟，然后在曙红中染色3分钟。将切片用不断增加的乙醇浓度脱水，在二甲苯中清除，并使用DePex盖玻片。对于免疫组织化学，在柠檬酸盐缓冲液中进行热抗原回收。这些部分以0阻塞。在0.3％TritonX中1％的牛血清白蛋白和3％的正常山羊血清1小时，并用一抗探测1小时。Anti-Ki67与组蛋白简单染色剂MAXPo结合使用，然后进行组绿检测。将新鲜的大块组织进行核染色，方法是将其与4'，6-diamidin-2-phenylindol孵育30分钟。
　　 非线性多峰显微镜分析已在其他地方详细介绍了。不久，使用两个在780和1005nm处发射皮秒脉冲的光纤激光器来激发CH2对称拉伸振动。使用激光扫描显微镜对激光束进行光栅化，然后将其通过×20水浸物镜聚焦在样品上，从而形成焦点约0.5um。在透射或反射配置中收集633至647nm范围内的CARS信号和381至399nm范围内的SHG，而在以下情况下始终以反射配置收集内源性TPEF：500至550nm的范围。将CARS，TPEF和SHG强度图像合并并显示为RGB图像。从OP接收到的新鲜样品均经过成像。将未固定的冷冻切片在PBS中复水以恢复组织形态，并盖上盖玻片，然后进行非线性多峰显微镜检查。几个单个图像150×150微米大具有高分辨率的获取，以使微形态参数的清晰可视化。由盲法观察者在每个样品的80至120FoV上评估组织特征的存在。使用平铺程序获取较大的图像，以可视化超出显微镜FoV的结构。
　　 非肿瘤性人脑组织和正常外周神经，成胶质细胞瘤，高低级神经胶质瘤，脑膜瘤，神经鞘瘤，黑素瘤转移灶，乳腺癌，肺癌和肾癌的冷冻切片和新鲜组织活检通过无标记非线性多峰显微镜分析，揭示了不同实体的特征形态化学特征。在肿瘤切除过程中获得的人脑肿瘤活检切片，用于组织病理学评估。活检部分约为几平方毫米，包含正常组织和肿瘤之间的边界。以高细胞密度和血管瘤的区域易于从正常脑组织。Ki67的增殖染色证实正常组织没有被肿瘤细胞浸润。样品右侧的肿瘤区域显示出的CARS信号强度通常比左侧的正常组织低。脑肿瘤被耗尽的脂质，从而产生较低的CARS信号，使肿瘤的清晰的可视化边界线。
　　 通过无标记多光子显微镜显示的组织微观形态的详细分析显示，正常组织和肿瘤均不是均质的，这强烈影响了局部CARS信号强度。正常组织局部显示由于轴突结构而具有强烈的CARS信号的区域，以及由于轴突结构较少而主要包含具有点状荧光的大细胞的区域以及具有较低CARS信号的区域。在正常组织和肿瘤之间的边界处，强烈的CARS信号可以看到大的脂滴，很可能是细胞外的脂滴。必须指出的是，它们在组织学制备过程中会溶解，因此在所有参考染色中都不存在。血管是在这些相同的区域由胶原蛋白的SHG信号和弹性TPEF信号识别。肿瘤既显示细胞活力高，CARS信号强度低的重要肿瘤区域，也显示坏死区域。通过H＆E染色核密度降低和Ki67染色证实缺乏增殖细胞，可以识别坏死。肿瘤组织在坏死的边界的特点是小脂滴，也由高CARS识别的信号强度CARS信号上12个区域20×20微米的强度进行评价大型分布式在图中示出的非常相同的区域d-H，提供的证据表明，正常组织和肿瘤组织可以在本地具有相同的CARS信号强度。最高平均CARS信号是在白质和与所述大的细胞外脂滴的区域中测量。重要肿瘤的平均CARS信号强度最低，这与正常组织明显不同。但是，含有脂质液滴的肿瘤组织中的平均CARS强度与正常脑组织没有显着差异。可以从正常脑组织中识别出重要的肿瘤，与肿瘤相比，正常的脑组织具有更高的CARS信号。这在肿瘤组织内脂质滴积累的情况下并不总是有效的。在将来使用内窥镜方法的临床应用中，组织微观形态的评估可以比仅评估CARS信号强度更好地帮助将肿瘤与正常组织区分开。为此，需要详细表征正常神经组织与肿瘤的特征。
　　 从耐药性癫痫手术中获得的人脑组织标本可作为非肿瘤组织的微观形态的参考，其中切除了海马和颞叶。另外，分析了来自尸检的皮质组织。海马结构清晰，无标签的非线性多峰显微镜清楚地识别出白色和灰色区域。由无标记的非线性多峰显微镜产生的人海马组织的单FoV图像，参考同一组织切片的H＆E染色。白质主要由髓鞘轴突形成，由于髓鞘的脂质含量高，该轴突产生强烈的CARS信号。神经质细胞体形成灰质，通常在细胞质中显示脂褐素颗粒的点状荧光。从癫痫手术获得的颞叶白质和灰质以及从尸检获得的皮质区域。它们显示出与海马样本相似的微观形态。血管是脑实质内唯一富含胶原蛋白和突出SHG信号的结构。周围神经，如腓肠神经由大的轴突形成，这些大的轴突被胶原神经内膜包围，并分组在被会阴神经膜包围的束中。
　　 在再水化冷冻切片上评估了原发性肿瘤的非坏死性肿瘤组织的典型微观形态，所有原发性肿瘤的形态化学都与正常神经组织完全不同。这些差异在150×150微米的小的FOV是明显。它们的特征在于高细胞性，很少或没有细胞显示出强烈的荧光。胶质母细胞瘤的特征还在于，细胞内脂质滴的频繁发生，类似于新的胶质瘤活检组织的微观形态，这在其他地方已经得到解决。脑膜瘤也显示出高细胞性。与衍生出的脑膜相比，它的形态也完全不同，因为带有强烈TPEF和SHG信号的脑膜的致密胶原蛋白-弹性蛋白网被肿瘤细胞所取代。与组织学染色相比，通过非线性多峰显微镜成像的神经鞘瘤的典型形态，肿瘤组织的结构与正常神经显着不同。肿瘤组织排列成束状结构，相应地在H＆E染色中，纺锤形细胞散布着胶原纤维和束。经常观察到巨噬细胞和泡沫细胞。此外，CARS使肿瘤内的偶发轴突可视化。标准组织学染色未突出轴突的存在，但在许多通过免疫组织化学分析的神经鞘瘤中证实了轴突的存在。在冷冻切片的非线性多峰图像上评估了非坏死性脑转移的典型微观形态。所有转移灶均显示出高细胞性，并且组织形态与非肿瘤性脑组织显着不同。乳腺癌转移瘤中通常含有大量的脂滴。所有类型的转移灶均显示胶原蛋白排列在与小血管相关的管状结构中。此外，肾癌转移显示胶原纤维似乎随机分布在组织中，并构成肿瘤ECM的组成部分。黑色素瘤通常包含具有强烈荧光的细胞，它们均匀地分布在细胞质中。通过与组织学染色比较，将这些细胞识别为黑色素瘤细胞。
　　 基于对所有脑肿瘤样本的非线性多峰图像的分析，发现以下特征的存在对于从高细胞性中区分肿瘤组织正常是有用的：细胞内和细胞外脂质滴，纤维状胶原蛋白，扩散荧光。在所有肿瘤活检组织中采集的单个FoV上评估了它们的发生，在所研究的45种肿瘤中，有44种观察到至少一种特征。但是，在一个脑胶质瘤WHOIII样本中没有观察到这些特征，在其他脑胶质瘤WHOIII样本中只有很少的FoV中发现了这些特征。在所有胶质母细胞瘤，神经鞘瘤和转移患者中均观察到多种特征的组合，尽管在分析的FoV中发生率有所不同。在胶质母细胞瘤，乳腺癌和肾癌以及黑色素瘤转移的所有样品中均观察到细胞质和细胞外脂质滴。在低发生率的低度神经胶质瘤WHOI中也观察到了它们。例如，细胞外脂质滴的存在增加总是与坏死有关，这是胶质母细胞瘤以及大转移瘤的形态学关键特征。
　　 尽管正常脑实质中的纤维状胶原的存在仅限于血管壁，但在肿瘤样本的主要部分中观察到许多纤维化结构，其形式为分布在肿瘤实质和血管中的胶原纤维的形式。形态异常。发现脑膜瘤，神经鞘瘤和某些类型的转移在实质中表达大量胶原，并且与典型的组织学发现一致。富含胶原的突出而异常的脉管系统，通常表现为肾小球毛簇或纤维化的透明化血管，分别在胶质母细胞瘤和神经胶质瘤WHOI中观察到。明显的血管生成产生形态异常的血管，该血管是曲折的，混乱的并且具有较大的直径。这些结构通常大于单个FoV，可能使其难以识别。但是，病理性血管的微观形态与非肿瘤组织的直的，薄壁的正常血管仍存在显着差异。在几个样本中观察到弥漫性弱荧光，主要集中在周围的血管或组织腔，与肿瘤类型无关。如在其他脑部病理学中已经发现的，这归因于白蛋白渗漏，并且可能与血管通透性增加和血脑屏障功能丧失有关，这是异常肿瘤脉管系统的另一个特征。
　　 目前，使用可用于研究实验室的现代扫描显微镜证明了用于脑部肿瘤描绘的多模式CARS显微镜。这些系统允许通过拼接多个图像来获取大图像。通过这种方法，肿瘤边界是明确主要基于CARS强度对比。该技术在手术室中的翻译需要将其集成到类似内窥镜的系统中。不同的方法已经显示出或者基于使用GRIN透镜，光纤，多芯光纤或其他类型的特别设计的纤维。对于所有这些系统中，在FOV由80和300微米之间。原则上可以拼接多个图像，但实际上仅用于实验室内部演示。在真正的术中原位光学活检中，组织评估应基于在切除边界的多个位置获取的单个FoV图像所携带的信息。单个小图像显示组织的微观形态和细胞形态，但无法识别较大的解剖结构。因此，海外医疗网研究人员解决了由150um大的单个FoV图像提供的信息，以区分正常脑组织中的赘生性组织。在冷冻切片和未处理的新鲜组织标本上评估了无标记非线性多峰显微镜可视化典型肿瘤特征的能力，表明所有观察结果均可转移。
　　 在正常组织中，典型的结构是轴突束和神经元。两者在单个FoV图像中均清晰可见。识别轴突的功能对于节省功能非常重要。在这里，证明只有在脑肿瘤中才发现某些特征，而在非肿瘤性脑中则没有。肿瘤的特征可以是多种特征的组合，并且可以在结合CARS，TPEF和SHG获得的单个FoV图像中清楚地识别所有特征。除了细胞密度和形，其已经在别处讨论，研究人员在这里表明，这些特征包括在异常的血管形成和肿瘤ECM脂滴蛋白和胶原蛋白的表达。CARS清楚地显示了细胞质脂质滴。它们没有通过组织学染色显示，但是构成了许多类型癌细胞的特征，而在正常脑组织中却没有。癌细胞需要大量脂质才能合成维持高增殖水平所需的分子。响应缺氧，癌细胞中的脂质获取得以增强，这是肿瘤的结构和功能异常血管形成的结果。在神经胶质瘤中，发现细胞质脂质滴独立于肿瘤等级。已知它们会在低氧条件下积累，但它们的形成在坏死之前。同样由CARS显示的细胞外脂质滴是胶质母细胞瘤和转移的特征。它们是坏死的标志，其与肿瘤恶性肿瘤相关。因此，脂滴的量是区分肿瘤与正常组织的重要参数。
　　 肿瘤的侵袭既诱导胶原蛋白的产生以促进新血管的生长，又使分布在组织内的ECM中的胶原蛋白表达上调。正常的大脑基本上没有胶原蛋白。因此，薄壁组织中胶原蛋白的丰富度清楚地表明了病理状态。SHG同样显示形态和异常血管的发生，而TPEF显示BBB功能的丧失。BBB功能的缺乏是血管改变的结果，并构成了恶性肿瘤的重要特征，通过给予荧光素钠也可用于术中指导。血管异常是脑肿瘤特别是胶质母细胞瘤的重要诊断特征。这些功能可能无法始终在单个FoV图像中完整显示，并且它们的识别可能仍然存在问题。然而，即使不能清楚地将其分配给改变的血管网络或ECM上调，FoV内SHG信号的任何变化模式也都清楚地表明了脑部病理。
　　 尽管未找到能够识别所有脑肿瘤的单个参数，但所有研究特征的组合为识别肿瘤组织提供了强有力的指示。与非病理组织相比，在胶质母细胞瘤，神经鞘瘤和转移灶中观察到的不同特征的结合使得对这些肿瘤的识别相对简单，并且它们的高发生率有望用于术中应用，由于时间问题，只能获得有限数量的FoV。但是，这里分析的I级和III级神经胶质瘤似乎缺乏上述特征。因此，对于神经胶质瘤而言，细胞性和细胞形态的额外评估至关重要。提出的结果强烈暗示了在内窥镜CARS-TPEF-SHG图像中成功识别脑肿瘤的可能性。然而，为了使非线性内窥镜在医疗实践中得以部署，仍应解决一些技术挑战。大量的研究致力于设备的小型化，因此不同的研究小组成功地使用不同的方法将非线性显微镜技术集成到了小型设备中。在这两个刚性目前，解决方案和灵活内镜检查报道。应进一步努力将此类设备集成到商用内窥镜系统中，同时还要注意电气和激光安全性问题。此外，内窥镜设备的设计应使其远端可以消毒，也可以插入一次性无菌塑料盖中。专门用于神经外科，还应预见与神经导航的整合。解决这些问题将能够测试手术室内部的内窥镜设备。为此，已经解决了体内神经胶质瘤划界的挑战，并证明术中使用5-ALA不会妨碍CARS显微镜的应用，但可作为评估术中试验中CARS显微镜的重要参考。
　　 总之，通过使用小型FoV来模拟内窥镜系统的使用无标记的非线性多峰显微镜，分析了不同的良性和恶性颅内肿瘤。确定了几种可用于诊断的组织特性，以区分肿瘤组织和正常神经实质。通过开发用于在较大数据集上进行肿瘤识别的自动形态计量分类工具，将来可以利用CARS，TPEF和SHG的组合信息。这些结果突显了无标记的非线性多峰显微镜技术在术中快速组织成像中的巨大潜力，并为将来利用内窥镜设备进行其他在线切除指导提供了重要前提。