儿童弥漫性桥脑部神经胶质瘤 |
尽管有数十年的研究,弥漫性桥脑神经胶质瘤多发于脑干,主要影响儿童,只有不到10%的患者存活超过2年。通过全基因组测序和RNA测序肿瘤的分子谱的最新进展支持个性化,基因组引导的临床试验,其可以促进新的治疗性干预的发展为DIPG的发展。DIPG组织的分析主要限于死后检查获得的标本,因为手术活检被认为具有高风险。但是,使用现代手术技术,可以在诊断时进行活检并具有可接受的风险,并且在最近几年中已被越来越多的人接受。这种变化在临床实践中已经导致DIPG相关分子数据的可用性显著增加。尽管临床和放射学表现均一,但DIPG在分子上是异质的,并且在单个肿瘤中存在多种途径的失调。单药治疗方法可能会失败,应该对联合治疗进行研究,并且需要精确的药物治疗方法。在这项PNOC003试点研究中,海外医疗网的研究人员评估了针对患有新诊断DIPG的儿童实施这种精确医学策略作为多机构试验的可行性。研究人员还测试了开发患者来源的细胞系并在复发和尸检过程中对肿瘤以及在病程中从血浆中分离出的ctDNA进行纵向分析的可行性,所有这些目的都是为了告知下一代临床试验。
PNOC003是一项多机构临床试验,使用分子靶向疗法对多达4种经FDA批准的药物进行了基于对初诊DIPG的儿童中具有WES和肿瘤RNAseq的配对肿瘤进行基因谱分析的药物。患者于2014年9月至2016年1月之间参加了可行性研究。参与该可行性研究的地点包括加利福尼亚大学旧金山分校;儿童国家卫生系统;以及加利福尼亚大学圣地亚哥分校。转化基因组研究所在临床实验室改进修正案批准的环境中进行了WES和RNAseq。根据影像学发现对患者进行活检之前已入组。随后排除病理结果不支持DIPG诊断的患者。TGEN将WES和RNAseq的结果以及药物基因匹配的结果提交给专门的肿瘤委员会,该委员会至少由三名小儿神经肿瘤学家和一名专职的神经药物学家组成。根据肿瘤板的治疗方法,治疗建议是可选的。追踪每位入选受试者的临床和影像学终点以及ctDNA收集,直至首次进展。受试者可以选择进行重复的活检以及重复的WES和RNAseq分析。
受试者在参与的临床部位进行了活检,作为标准临床护理的一部分。立体定向穿刺活检是通过无小脑中线通过中小脑梗进行的。通过参加研究的神经外科手术椅对参与的神经外科医师进行入学前培训来完成不同中心外科手术程序的标准化。委员会认证的神经病理学家验证漫胶质肿瘤的诊断和估计的肿瘤百分比。如果肿瘤含量至少为50%,则对样品进行鉴定,然后发送至AshionAnalytics。还根据机构规程收集尸检尸体样品。TGEN的临床门户网站中输入了包括患者人口统计资料,原发肿瘤周围的详细信息以及其他相关信息在内的临床数据,以生成未确认的临床报告。
配对的肿瘤标本的WES用于鉴定体细胞编码点突变,小的插入和缺失,拷贝数变化和结构事件。肿瘤RNAseq用于鉴定RNA融合并进行差异表达分析。如先前所述进行体细胞变异检测,拷贝数分析和易位以及RNA融合检测。使用Cuffdiff和DESeq2,并利用从五个单独的商业购买的RNA对照生成的RNAseq数据进行差异表达分析。校正后的p值≤0.05和log2倍数变化≥2.0被用作显着变化的阈值。WES进行了14位受试者;对一名受试者P-05进行了562基因靶向外显子组的研究。支持信息方法中提供了有关WES和RNAseq分析的其他详细信息。向药物肿瘤委员会报告了与药物规则相关的基因的显着表达变化。
使用定制的一组药物规则和启发式方法,将特定的变化与研究药典中的潜在疗法相匹配。研究药典包括了所有的肿瘤药物在美国药典,以及选择非癌症的药物。由于出现新的证据表明它们在癌症相关途径中的潜在活性以及临床经验表明这些药物具有良好的耐受性,因此将这些重新定位的药物包括在内。其他详细信息在支持信息方法中提到。分子谱分析结果作为解释性基因组报告提交了多学科分子肿瘤委员会,列出了特定的分子发现和相关的治疗关联。基因组学报告包括触发研究药物规则的所有变体。DNA水平事件是治疗靶向的首要任务。其中包括与相关RNA变体相关的DNA事件;在RNA水平也检测到的DNA突变被赋予最高优先级。较低优先级仅归因于RNAseq衍生的差异表达数据触发的关联。提供了所有报道的变化的描述性信息,包括特定像差,DNA和RNA等位基因频率,描述DIPG中变化作用的专家注释以及支持该变化与潜在治疗剂之间关联的精选证据。还包括与中枢神经系统渗透和指定疗法潜在的CNS活性有关的药代动力学特征。专门的肿瘤委员会就治疗建议达成了共识,包括组合和引入推荐药物的剂量和推荐顺序。优先考虑具有已知儿科剂量和中枢神经系统充分渗透证据的药物。旨在根据先验规则来针对使用同一药物的每种分子变化进行评估,以评估对所选药物的科学支持并评估药物组合的临床可行性。肿瘤委员会将可获得毒性数据的联合策略列为优先事项。科学证据表明该代理对特定改变表现出活性的优先顺序如下:临床数据优先于临床前数据DIPG相关模型中的临床前数据优先于非DIPG特定模型中的数据,例如高级神经胶质瘤或其他脑肿瘤模型。以科学优先级顺序进行可行性评估,其中包括对建议药物或药物组合可用的任何临床数据或已发表证据的审查。有关药物组合可行性的可用信息通常非常有限。仔细审查了个别药物的副作用概况,以评估临床应用的可行性并潜在地避免明显的重叠毒性。专注于具有非重叠毒性的联合策略,因此也整合了重新定位的药物。
在NantOmics对WGS进行了原始临床活检和复发尸检后剩余的肿瘤和组织DNA的检测。WGS队列还包括来自三个患者来源细胞系的基因组DNA。DNA随机片段化,并构建了100bp的配对末端文库。肿瘤样品以60倍覆盖率测序,血液样品以30倍覆盖率测序。其他详细信息在支持信息方法中提到。在可行时尝试开发细胞系模型。将活检组织收集在冬眠A培养基中,进行机械分离,然后进行红细胞消化,并在肿瘤干培养基中扩增。使用标准血浆收集程序在基线以及每次MRI收集ctDNA。使用QIAamp循环核酸提取试剂盒进行CtDNA提取。对所有ctDNA样品进行液滴数字PCR处理,并使用正向和反向引物对H3F3A和HIST1H3B进行预扩增。前置放大是该方案成功的关键步骤。前置放大产物用于通过液滴在等离子体叶绿体DNA的H3K27M突变的分析数字PCR;使用先前描述的灵敏度和特异性标准。这项研究的主要目的是评估在获得组织后的21个工作日内,基于WES和RNAseq分析提供治疗建议的可行性。可行性定义为至少有85%接受活检的患者在指定时间范围内发出治疗建议。在15名患者的样本量中,如果真实比例为85%,则单尾90%置信区间的下置信度边界至少有60%的可能性为82%。研究人员利用集中式临床试验管理系统收集临床数据。加利福尼亚大学旧金山分校癌症中心数据安全和监视委员会监视了该试验的安全性和操作规程。在任何患者入组之前,每个站点均已获得机构审查委员会的适当机构批准,包括有关机构整个方案的最终批准。
共有17例患者入选,其中2例根据病理学检查不合格:诊断包括一名患者的细胞性星形细胞瘤和第二层患者的带有多层花环的胚胎肿瘤,C19MC改变。剩余的15名受试者包括6名女性和9名男性患者,中位年龄为7岁。从活检到放射开始的中位时间为13天。总共有9例不良事件与手术有关。其中有8例属于1级,一名患者的基线2级眼球震颤恶化至3级,在活检后2天内恢复到基线。
大多数受试者的肿瘤含量超过90%。肿瘤WES的平均平均靶标覆盖率为436倍,RNAseq的平均映射读取数为228M。由于降解的RNA未能通过质量控制RNA完整性编号,一名患者的RNAseq尚未完成。由于缺少此样品的RNA数据,因此被分类为可行性失败。治疗建议包括各种FDA批准的药剂,包括靶向肿瘤剂和重新定位剂。Panobinostat紧随其后的是甲苯咪达唑。甲苯达唑是一种抗蠕虫药,对多种激酶具有抑制活性以显示在其它肿瘤类型的抗癌活性,并具有潜在的CNS活性。
两名受试者在进展时进行了一次活检,并根据重复的WES和RNAseq发布了第二份肿瘤板治疗建议。对于P‐06,WES在两个肿瘤样本中发现了初始诊断和进展活检之间的核心相似性,包括H3F3A,ATRX和PPM1D突变。WES还透露额外的和潜在的治疗信息的改变只进展样品中检测到,对于第二个受试者,在进行中的样品的WES分析显示与原发性肿瘤相比,复发性肿瘤中存在大量重叠的突变,包括H3F3A,PIK3R1和PPM1D中的共享突变。甲亚克隆TP53突变以5%的低DNA等位基因频率报道原发性肿瘤,但没有满足累进样品中的临床报告阈值。包括P‐06的原发和进展性肿瘤样本以及P‐07的原发,进展和尸检样本。WGS发现在两个进展样本中均保留了建议治疗的基因突变。WGS分析进一步发现,在癌基因是在逐行肿瘤多个附加的改变。这些结果支持了进行性DIPG肿瘤中可能的克隆进化和选择的概念。
为了为未来的分子指导临床试验提供信息,研究人员调查了WGS是否对DIPG的治疗前景提供了其他见解。WGS检测到报告的所有编码点突变,均可通过临床WES在临床上应用。使用PNOC003研究药典和药物规则评估由WGS检测到的变异体。从WGS中发现了另外两个触发药物规则的改变,特别是P-11中的IDH1,这是临床试验中靶向神经胶质瘤的明确定义突变和ATRX在P‐07中。这暗示了TP53突变是DIPG中观察到的基因组不稳定和相关结构异质性的可能原因,但是,需要更大的样本集才能得出具有统计学意义的结论。使用WGS评估细胞系模型对匹配的原发肿瘤的保真度。与匹配的原发肿瘤相比,细胞系保留了关键的复发性基因组改变,在P-05细胞系中也检测到针对P-05的ATRX缺失。尽管保留在神经球中,但在该患者肿瘤细胞系中未见到在同一患者肿瘤中检测到的拷贝数增加。另外,细胞系显示出在原发性肿瘤中未检测到的其他编码突变。在成人中枢神经系统癌症中,ctDNA用于肿瘤分析,有助于诊断和监测对治疗的反应。能够评估H3F3A和HIST1H3B野生型和突变等位基因,其允许评估突变等位基因频率。MAF0.001%以上被认为是阳性的检测。可行性研究中的八名患者遵循了分子肿瘤委员会的建议,而七名则没有。遵循治疗建议的一名患者仍然活着;由于诊断后30.8个月和开始研究治疗后27.4个月的进展而退出治疗。该患者的肿瘤为H3野生型,表现出以下可靶向突变:该患者最初接受卡铂治疗以靶向ATRX;二甲双胍靶向IGF1R拷贝数增加和过表达;甲苯咪唑靶向PDGFRA过度表达;和依托泊苷靶向TOP2A过表达。遵循治疗建议的患者从至少一种研究药物开始治疗的中位时间为3.8个月,从联合研究药物开始的中位时间为2.9个月。尽管本研究的可行性部分并非旨在确定治疗效果,但遵循治疗建议和未遵循治疗建议的患者的总中位生存期分别相似,分别为13.8个月和13.2个月。
研究人员报告了在多机构环境中对患有DIPG的受试者使用下一代测序实施精密医学方法的可行性。这是第一项试验,证明了基于基因组的实时多药治疗方法可用于治疗初诊DIPG的患者。影像学推测的DIPG活检一直是历史上有争议的话题。在过去的5年中,DIPG儿童的手术活检显示安全可行,风险可接受。尽管这些试验显示出与手术相关的低死亡率和发病风险,但当前的可行性试验是首次将此类活组织检查用于通过WES和mRNA表达分析对肿瘤的突变和表达格局进行全面的临床表征,并利用这种分析来通过组合靶向方法实时告知治疗。这种方法对于大多数患者确实是可行的,并且专门的肿瘤委员会可以在临床相关的21个业务范围内提供多达4种FDA批准的药物的综合治疗计划。根据影像学,在17名受试者中有2名被认为患有DIPG,但被发现有其他诊断。这些发现突出了活检方法的诊断实用性,并表明即使在经验丰富的儿科神经肿瘤学中心,仅影像检查也会产生误导。80%的受试者的DIPG携带了癌蛋白H3K27M突变,73%表现为TP53突变,27%表现为PDGFRA改变,33%的患者表现为ATRX改变,DIPG中的组合突变模式。没有两名患者具有相同的突变态势。一名患者的DIPG携带了BRAF突变以及H3F3A突变。现在已经在几种小儿中枢神经系统肿瘤中报道了这两种突变的同时发生。不幸的是,该患者在诊断后仅8个月就进展并死于疾病一名患者显示PPM1D和TP53突变同时出现。通常,PPM1D和TP53突变是互斥的,只有一个先前报道的DIPG例外,它在H3.3K27M-TP53和H3.3K27M-PPM1D中表现出克隆异质性。鉴于小儿肿瘤中基因组改变相对较少,RNAseq的添加可用于指导治疗。RNAseq的主要挑战仍然是如何利用适当的对照组织进行差异表达分析。为了解决这个问题,使用了多个独立的对照RNA。还需要进行其他研究来分析和整合RNAseq数据,以就DIPG来源细胞的身份提供未来的治疗策略。作为该可行性试验的一部分,评估了在首次进展时进行活检的可行性。DIPG的分子谱随治疗方法以及在肿瘤进展的过程中发生变化,许多中心现已在复发时不断获取肿瘤组织用于各种脑肿瘤诊断。两个主题进行了重复活检。对于一个主体,复发肿瘤表现出EGFR途径的活化通过在一个新的活化突变EGFR以及焦点EGFR扩增,除了一个PIK3R1突变。RNAseq分析进一步证实了途径上调。而EGFR突变在小儿DIPG中很少见,在成年胶质母细胞瘤中已报道EGFR胞外配体结合域中的突变,包括R108K突变。这些新的改变均存在于初始肿瘤,但在初步诊断中没有检测到,可能是由于空间异质性。考虑到这些脑干肿瘤的雄辩区域,尚未着手进行这些肿瘤的局部活检,从而限制了研究人员在诊断时评估空间异质性的能力。由于病情进展时家庭再次接受活检的接受率低,这种方法对确定肿瘤内潜在的治疗相关变化的吸引力较小,因此需要其他侵入性较小的方法。
探索了收集ctDNA的功能,以确定是否可以可靠地检测DIPG的关键驱动程序突变之一。先前的研究表明,在中线神经胶质瘤儿童的脑脊液中可以检测到这种特异性突变。由于担心疝气,DIPG患儿很少收集到脑脊液。能够在诊断时在85%的病例中和在治疗期间100%的病例中检测到H3K27突变。这表明扩展该平台以评估其他驱动程序突变的可行性,其最终目标是使用ctDNA作为诊断和预后工具来评估与治疗和进展相关的分子改变。能够建立几种患者来源的细胞系。根据测序分析,这些细胞系保留了DIPG典型的几个关键基因组改变,但是,细胞系与其匹配的原发肿瘤不同,显示出多个其他变化,这些变化反映了克隆选择或建立这些细胞系时产生的从头突变。这些发现强调了这种模型系统的潜在局限性。为了解决与儿科DIPG临床下一代测序相关的关键决策和平台实施挑战,研究人员回顾了WGS分析并将结果与WES进行了比较。WGS除了患者P-05以外,没有透露任何其他治疗建议。WGS研究越来越多地牵涉到癌症中反复出现的突变调控位点,并由于突变或结构基因组改变而改变了增强子的活性。非编码RNA和改变的RNA加工在调节癌症生物学中的重要性和普遍性已在多种癌症中得到证实。表观遗传失调与非编码突变和改变的RNA过程的组合可以显着改变将要用于DIPG的可治疗的治疗途径。基于在癌症相关靶标上观察到的平台差异并支持RNAseq解释,建议下一代DIPG临床试验应包括一个更全面的平台,其中包括WES,WGS,RNAseq以及可能针对性强的深度报道专家组。尽管此可行性研究并未要求患者遵循肿瘤委员会推荐的精密疗法,但研究人员已对当前方案进行了修改,以招募更多的患者。患者和家属不遵循治疗建议的原因是多方面的。一些受试者最终在活检后参加了另一项临床试验。其他家庭过渡到注重生活质量的治疗选择,而其他家庭则选择采用替代疗法。目前的可行性研究并未显示出研究人员的精密医学方法对生存的益处。但是,在设置非常小的样本量时必须考虑到这一点。该试验的可行性队列并非旨在确认疗效或对该方法对总体生存的影响做出判断。
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