儿科高级神经胶质瘤是儿童中最致命的恶性肿瘤之一。尽管最近在了解这些肿瘤的分子基础方面取得了进展，但pHGG患者的临床预后尚未改善。pHGG的特征是表观遗传修饰和DNA损伤修复基因的缺陷。然而，对于在pHGG中失控的非突变DNA损伤修复基因知之甚少。FanconiDNA修复机制的破坏与一种称为Fanconi贫血的综合征相关，与多种恶性肿瘤的发作有关。FAconi贫血是一种由一种Fanconi蛋白编码的基因的种系突变引起的遗传病。由于缺乏可操作的Fanconi机械，FA与基因组不稳定和对DNA交联类似物的强烈敏感性有关。范科尼贫血组D2是范科尼修复机制的核心成分之一，与FANCI结合后可诱导细胞对DNA损伤的反应。与带有突变的Fanconi成分的癌症相反，对于具有放松但尚未突变的Fanconi核心成分的癌症知之甚少。
　　 在这项研究中，显示FANCD2表达水平随神经胶质瘤级别的增加而增加，这得到了早期发现的支持。假设HGGs在很大程度上依赖于Fanconi系统进行DNA修复，并且这种机制的破坏会使这些肿瘤易于发生DNA交联剂，如在FA患者中所见。为了研究pHGG细胞中FANCD2的缺失消耗是否会导致FA样表型，从而导致其对血小板类似物的敏感性更高，用卡铂联合celastrol可渗透性化合物）处理了原代pHGG细胞已经显示出通过蛋白酶体引起FANCD2的降解。在实验中选择卡铂比其它铂化疗药物，因为它的相对温和的神经毒性副作用并报告给穿过BBB的能力。在这里显示通过Celastrol处理耗尽FANCD2会引起停滞的叉子复制，并引起对pHGG原代细胞中DNA交联剂卡铂的敏感性。此外，显示与单药疗法相比，用这种药物组合治疗携带原发患者源性pHGG异种移植物的小鼠可延长生存期。
　　 HSJD-DIPG-07是蒙特罗·卡卡波索博士的礼物。来自Raabe博士和SU-DIPG-IV和SU-pcGBM2来自Monje博士。VUMC-DIPG-10细胞是通过DIPG尸检在VU大学医学中心建立的，而VUMC-DIPG-F和VUMC-DIPG-G是源自活检的H3.3K27MDIPG培养物。VUMC-HGG-05，VUMC-HGG-09和VUMC-HGG-14是切除来源的胶质母细胞瘤。VUMC-HGG-11是具有H3.3K27M突变的丘脑中线神经胶质瘤。通过全基因组测序证实，所有模型均为FANCD2野生型。如先前所述细胞神经球培养。仅在进行确诊的支原体阴性和短串联重复分析以确保细胞系身份时，才使用细胞。以下表达数据集用于研究患者之间的mRNA表达：
　　 健康的脑，健康小脑，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，小儿HGG，小儿DIPG。使用神经胶质瘤数据集GSE43378研究了与FANCD2表达的生存相关性。Celastrol，卡铂，MG-132和托泊替康购自开曼化学公司作为测定制造商操作规程中培养物中活细胞数量的方法。使用TeControlInfinite200阅读器，使用iControl1.10软件测量发光度。协同作用评分基于指定浓度下处理后96小时的平均细胞生存力，并使用Synergyfinder软件进行计算。如先前所述进行免疫印迹。使用补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液分离蛋白质。将膜与兔抗FANCD2，小鼠抗磷酸组蛋白H2A.X一起孵育，兔抗RAD51或小鼠抗肌动蛋白。随后，将膜与山羊抗兔IRDye800CV二抗或山羊抗小鼠IRDye600CV抗体，以进行进一步的分析和统计。未处理组和Celastrol处理组之间所有差异表达基因的列表作为补充文件1添加。
　　 在专门用于荧光成像的GreinerSCREENSTAR96孔板中，在添加了FCS的TSM中培养VUMC-HGG-09细胞。将细胞用Celastrol，卡铂或它们的组合处理12小时。此后，将细胞用冰冷的PBS洗涤并固定在4％多聚甲醛中。阻断和通透性，一抗，兔抗FANCD2和小鼠抗将-磷酸-组蛋白H2A.X加入到载玻片中，在4℃下孵育过夜。在第二步中，将AlexaFluor488和AlexaFluor94在1℃下孵育1小时。RT。使用配备了HamamatsuORCAAG黑白CCD相机的40x和63x物镜，使用ZeissAxioObserverZ1倒置显微镜进行成像。根据用于细胞计数的自动粒子分析，使用ImageJ软件对yH2AX病灶进行定量2，然后进行自动单点选择叠加。
　　 为了检测DNA双链断裂，如先前所述进行中性彗星测定。不久，收集细胞，将8000个细胞在400ulPBS中稀释，并包埋在1.2ml1％低胶凝琼脂糖中。用100ul细胞悬液在Trevigen彗星试验载玻片上制成凝胶。为了裂解凝胶中的细胞，将玻片在裂解液中于37°C孵育过夜。第二天，将载玻片在室温下于电泳缓冲液。在电泳缓冲液中于20V进行电泳25分钟。随后，将载玻片用蒸馏水洗涤一次。为了染色DNA玻片，将其与在蒸馏水中稀释的2.5ug每毫升碘化丙啶一起孵育20分钟。使用配备HamamatsuORCAAG黑白CCD相机的20倍物镜，使用ZeissAxioObserverZ1倒置显微镜对单个彗星成像。使用CASP软件评估了单个彗星的尾巴时刻。对于每种条件，分析了50多个细胞。
　　 如前所述进行DNA纤维测定。简而言之，将细胞分别用25uMCldU和250uMIdU脉冲标记30分钟。用胰蛋白酶消化标记的细胞，在铺展缓冲液中溶解，然后在显微镜载玻片上铺展。使用3：1甲醇：乙酸将DNA纤维固定在载玻片上。将玻片用2.5MHCl处理1小时和15分钟以使DNA变性，然后在封闭缓冲液中孵育1h。为了检测CldU和IdU，将玻片分别与大鼠抗Brdu和小鼠抗BrdU孵育1小时。随后，将玻片用4％多聚甲醛固定10分钟，并与Alexa488标记的山羊抗小鼠和Alexa555标记的山羊抗大鼠一起孵育1.5小时。使用装有HamamatsuORCAAG黑白CCD相机的63x物镜，用ZeissAxioObserverZ1倒置显微镜对DNA纤维成像。使用ImageJ软件分析复制磁道的长度，并使用1um=2.59kb的转换因子。使用pLKO.1-shFANCD2.1和pLKO.1-shFANCD2.2的质粒如前所述建立FANCD2敲除细胞。
　　 4周大的雌性无胸腺裸鼠从CharlesRiverLaboratories购买，并按照欧洲和国家有关实验动物研究的指导原则饲养。适应一周后，VUMC-HGG-14细胞立体定向注射到纹状体中，并使用IVISSpectrum通过生物发光成像。当肿瘤生长在所有动物中均显示稳定增加的信号时，根据绝对BLI信号和最后两次测量之间的信号增加，将小鼠分为四组。A组静脉注射接受生理盐水，通过管饲法接受水。B组每周一次通过静脉注射和口服水接受卡铂。C组通过OG接受了天青素每天连续五天，并且在停药一周后进行第二轮为期五天的治疗，这次每天5mg/kg的天青素。C组通过静脉注射接受0.9％的盐水。组d用既雷公藤红素处理和卡铂作为B组描述和基于人道终点，其被定义为C.存活打进一个大于20％体重的从最高重量或严重的神经缺陷的损失。仅将在注射后两周内发生肿瘤转移到心室中的小鼠排除在研究之外，因为这些被认为是植入错误。
　　 达到人性化的终点后，将小鼠用20％Euthasol安乐死，然后收集大脑并将其固定在4％多聚甲醛中48小时。将固定的大脑包埋在石蜡中，进行人波形蛋白免疫组织化学染色。使用VectraPolaris自动定量病理成像系统对人波形蛋白染色进行成像。此外，对大脑进行了KI-67和裂解的caspase-3免疫组织化学染色处理。使用配备有由ZENPro-imaging软件操作的ZeissAxiocamICc5的ZeissAxio光学显微镜对KI-67和裂解的caspase-3染色进行成像。用于这些染色的所有大脑都来自完成完整治疗方案约三周后被安乐死的小鼠。使用单向方差分析评估了来自RNA测序数据的各组之间的mRNA表达。使用独立的t检验比较了体外细胞存活百分比。药物协同作用是使用Synergyfinder软件计算的，该软件使用零相互作用效价模型创建协同作用评分。使用Mann-WhitneyU检验比较了DNA纤维测定法和彗星测定法组。体内使用log-rank检验测试组之间的生存差异。使用MicrosoftExcel和GraphPadPrism进行统计分析。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
　　 为了评估Fanconi复杂基因的表达是否与神经胶质瘤级别相关，分析可公开获得的基因表达数据集中Fanconi基因的mRNA表达。因此，使用R2平台，该数据库包含来自大型患者队列的基因表达谱，包括用于比较不同癌症类型之间基因表达的工具。发现与健康的脑组织相比，FANG2在HGG肿瘤组织中的表达被上调。平均而言与健康的大脑相比，肿瘤组织的FANCD2上调了12倍。同样，FANCD2mRNA表达水平与神经胶质瘤等级显着相关，患者生存率也如此。此外，出国看病网研究人员发现与健康的脑组织相比，HGGs中的Fanconi复合物的其他基因明显过表达，这表明在HGGs中，FANCD2发挥了独立于经典Fanconi复合物机制的额外作用。为了验证患者队列的发现，使用人星形胶质细胞中的FANCD2蛋白表达作为健康对照，通过蛋白质印迹评估了一组pHGG细胞中FANCD2蛋白的表达谱。所有pHGG模型均显示FANCD2的表达，尽管表达水平不同，而人星形胶质细胞未显示可见的FANCD2蛋白表达。本研究中使用的所有pHGG模型的概述，包括分子背景和治疗历史的详细信息。
　　 为了测试FANCD2下调在出国看病网研究人员的pHGG细胞培养物中的作用，使用了植物衍生的Celastrol，据报道该植物通过蛋白酶体活性诱导FANCD2降解。因此用Celastrol处理了三种不同的pHGG培养物24小时，并且在所有模型中观察到FANCD2蛋白表达均大大降低）。然后，通过对基因集富集的参数分析，比较四种处理过的pHGG模型与未处理对照的RNA测序结果，使用KEGG数据库。该分析显示蛋白酶组基因组在未治疗组和Celastrol治疗组之间存在显着差异表达，表明在pHGG培养物中，Celastrol处理改变了蛋白酶体的活性。此外，未处理组和Celastrol处理组之间的比较显示FANCD2mRNA表达没有差异，这表明Celastrol以转录后方式改变FANCD2表达。结果通过治疗2个PHGG文化与蛋白酶体抑制剂“MG-132'进一步证实，接着雷公藤红素治疗，这救出FANCD2蛋白表达。总之，这些结果暗示蛋白酶体降解是在Celastrol处理后降解pHGG细胞中FANCD2的机制。
　　 因为在pHGG中FANCD2的过表达提示了Fanconi修复途径的依赖性，所以假设由Celastrol驱动的FANCD2降解可以使pHGG细胞对DNA交联剂敏感。因此，研究Celastrol和卡铂单一疗法以及两种化合物的组合对一组主要pHGG细胞培养物的影响。用两种化合物在一定浓度范围内处理细胞96小时，以确定细胞毒性IC50。Celastrol的IC50浓度范围为0.5uM至3uM，而卡铂的IC50浓度范围为10至24uM。联合治疗可协同增加细胞毒性，特别是当半毒性的Celastrol浓度与无毒的卡铂浓度组合时。在三种pHGG细胞系中使用拓扑替康进行的类似实验显示没有协同作用关于细胞生存力。在pHGG培养物中，shRNA对FANCD2的抑制作用导致对卡铂细胞毒性的敏感性与Celastrol处理相似，从而证实了所观察到的协同作用具有FANCD2依赖性。并非在所有FANCD2shRNApHGG培养物中都对Celastrol单药敏感，这表明需要使用触发剂来利用缺乏的修复机制。
　　 为了确定celastrol的协同作用是否与卡铂的DNA损伤作用有关，在通过单一化合物或联合治疗后通过免疫荧光检查了YH2AX的表达。尽管Celastrol单药疗法耗尽了FANCD2的表达，但未观察到DNA损伤标记YH2AX的积累。然而用卡铂处理VUMC-HGG-09细胞会引起YH2AX的核积累。当卡铂治疗与Celastrol联合使用时，病灶数量增加，导致YH2AX病灶在核内进一步积聚。通过Western印迹对不同的pHGG培养物获得了相似的结果，尽管在某些情况下，在Celastrol单药治疗中也观察到YH2AX表达增加。为了确认在Celastrol和卡铂联合治疗后YH2AX的积聚是双链断裂积累的结果，使用中性彗星测定法来确定DNA尾巴的长度，作为DSB的量度。在JHH-DIPG-01和HSJD-DIPG-07中，在Celastrol处理后观察到尾巴长度显着增加，而卡铂处理并未引起DSB的增加。联合疗法诱导的平均尾巴长度与Celastrol治疗组相似，表明Celastrol在治疗24小时后完全负责DSB的积累，这与YH2AX测量值矛盾。但其他机制可能也可以解释celastrol单和联合治疗之间YH2AX病灶的差异积累，例如复制叉的稳定性。最近的文献表明经由RAD51和SETD1A[FANCD2表达和复制叉稳定性之间的直接连接。因此，通过蛋白质印迹评估了Celastrol处理之前和之后这些蛋白的表达。在Celastrol处理24小时后，RAD51和SETD1A蛋白表达均下降。像细胞生存力测定法中的结果一样，在celeastrol处理后RAD51的下调似乎取决于FANCD2的存在，因为FANCD2的稳定敲低也会降低RAD51的蛋白质水平。为了进一步确认Celastrol通过耗尽FANCD2导致复制叉停滞，使用了DNA纤维分析法来分析DNA的合成速率。用Celastrol处理pHGG细胞24小时后，出国看病网研究人员发现与对照相比，所有培养物中复制叉的进程均明显降低，表明Celastrol阻止了复制叉。
　　 为了确定Celastrol和卡铂在体内的治疗效果，在携带患者来源的小儿胶质母细胞瘤异种移植物的无胸腺裸鼠中测试了这些化合物。该模型是由儿科患者的GBM的手术切除材料建立的，并在小鼠中显示出典型的GBM样生长模式。荧光素酶体外转导VUMC-HGG-14细胞，以便在体内监测颅内肿瘤负荷及时并使用STR分析进行了验证。通过生物发光成像证实植入后，在肿瘤植入后15天开始治疗，这时将小鼠分为四个等效组，Celastrol和组合）基于BLI信号强度。由于在第一轮治疗后未观察到毒性，因此在第二轮中，出国看病网研究人员将Celastrol剂量从2.5mg/kg增加到5mg/kg。没有观察到与治疗相关的毒性，并且所有小鼠均发展为GBM。以体重减轻20％或严重神经功能缺损为人类终点，出国看病网研究人员观察到与对照组或单药治疗组相比，Celastrol/carboplatin联合治疗组的存活率显着增加。在联合治疗组中根据每组的辍学原因，观察到神经功能缺损的趋势有所减少。此外观察到两组之间的体重正常分布，并且没有发现纵向BLI信号的趋势。通过免疫染色增殖标记物Ki-67研究治疗后肿瘤的扩散。在Celastrol和卡铂联合治疗后，Ki-67的表达降低，而在单药治疗的肿瘤和对照之间，在Ki-67的表达上没有观察到差异。此外，裂解的caspase-3作为细胞凋亡的标记物的免疫染色显示，在恶性和非恶性脑区域这四个组之间没有差异。
　　 在这项研究中，发现FANCD2可以作为抗卡铂在pHGG中诱导的毒性的保护剂。使用天然化合物Celastrol诱导pHGG细胞中FANCD2降解，并显示这为铂类似物卡铂诱导胶质瘤细胞中链间交联的积累创造了治疗窗口，从而导致细胞毒性。除了关于黑色素瘤和胶质母细胞瘤一些报道外，对于癌症中未突变的Fanconi蛋白的失调知之甚少。Fanconi核心成分FANCD2似乎主要在更具侵略性的神经胶质瘤中过度表达，并且蛋白质表达已显示与神经胶质瘤等级相关。该观察结果与基因表达分析相符，在分析中与健康的脑组织相比，发现HGG中的FANCD2上调很强。蛋白质表达分析还表明，与体外星形胶质细胞相比，在所有的FANCD2野生型pHGG细胞模型中FANCD2的过表达均与分子背景或治疗史无关。这种过度表达似乎是针对FANCD2特异的，因为与健康的脑组织相比，没有发现在神经胶质瘤基因表达数据集中其他Fanconi复合基因过度表达的程度相同。这可能表明，FANCD2起着HGGs至关重要的作用是从传统的范科尼修复机制，其依赖于范可尼核心复合物的形成鲜明。在体外pHGG模型中观察到，天青素以比文献中针对其他癌细胞类型更低的浓度影响神经胶质瘤细胞的生存力。与较低级别的肿瘤相比，HGG的增殖速度相对较快，突变负担较高，这可以解释为HGG可能依赖较高的FANCD2表达水平来恢复其复制错误。此外，表明Celastrol有效地以转录后的方式下调FANCD2蛋白的表达，而不会导致FANCD2蛋白的完全丧失。这可能解释了为什么Celastrolal治疗在体内如此耐受，因为健康细胞在低FANCD2表达水平下仍能存活。
　　 为了确认Celastrol引起FANCD2介导的前叉降解，使用RAD51和SETD1A作为该过程的标记。RAD51通过促进同源重组修复在DNA修复中发挥重要作用，并充当反向复制叉形成的促进剂，在其中保护新生DNA链免受核酸酶消化。最近的文献通过修饰组蛋白甲基化描述了FANCD2和RAD51之间的直接联系。FANCD2募集可调节组蛋白动员的组蛋白伴侣，使SETD1A介导的单甲基化发生在组蛋白3赖氨酸4位点。H3K4单甲基化对于组蛋白在反向叉的退叉臂上的可及性至关重要，这可稳定新生DNA3'端的RAD51细丝。由于RAD51通过稳定它来防止这种新生DNA的消化，所以RAD51充当了不受控制的DNA切除的保护者。假设FANCD2的转录后耗竭通过丢失的H3K4单甲基化而导致RAD51蛋白表达的丢失，这是SETD1A蛋白丢失的结果。因此认为SETD1A和RAD51的丢失是基因组不稳定性增加的标志。相应地，尽管与DSB形成相反，DNA交联似乎是在Celastrol处理后实现pHGG特异性细胞死亡的重要机制，但出国看病网研究人员还是使用yH2AX作为DNA损伤的标志物。yH2AX是DNA-DNA双链断裂或G2/M期阻滞一种广泛使用的标记物。但是，DSB也是长期未修复的DNA交联的结果。yH2AX表达在通过辐射诱导直接DSB后几秒钟达到峰值，而yH2AX水平在添加DNA交联剂后12至24h达到峰值。当细胞内修复机制无法修复这些链间交联时，DNA发生降解，DSB出现。此外，除了作为DNADSB的标记，yH2AX还被证明是停滞的复制叉的标记。因此，在Celastrol与联合治疗之间yH2AX病灶增加，而在这些组之间未观察到DSB的增加，这可能是链间交联积累的结果，是复制叉停滞的原因。当发现Celastrol和拓扑替康之间没有协同作用时，这些发现得到了进一步证实，后者与卡铂一样，是另一种临床相关的DNA破坏剂，但没有任何链间交联能力。
　　 在研究中，出国看病网研究人员使用Celastrol处理来诱导FANCD2降解。雷公藤红素是一种天然植物衍生物跨越血脑屏障，并发现有几个生理性质，包括较强的抗炎和抗氧化活性。由于天青素治疗并未在体内引起任何不良反应并且已经在传统东方医学中安全使用了多个世纪，Celastrol在HGG患者中具有广阔的临床应用前景。重要的是，尽管有其他适应症，但目前正在生产合成的Celastrol类似物，用于临床研究，这可能有助于临床上FANCD2抑制的翻译潜力。卡铂，其是有毒的小于顺铂和穿过BBB，已在患者中已使用了几十年并且步骤使用在HGG患者该化合物是高度可行的。体内使用胶质母细胞瘤原位异种移植模型进行的实验表明，与单药治疗组和非治疗组相比，用Celastrol和卡铂联合治疗的小鼠具有明显的生存获益。这与联合治疗组中增殖标志物Ki-67的表达降低有关，而在健康和恶性组织中均未观察到裂解的caspase-3的变化。尽管这保证了不存在由治疗引起的神经毒性，但是需要小心，因为在治疗后三周从每组的第一只脱落小鼠中收集了用于这些染色的大脑。这是研究的局限性，未来的研究应在治疗过程中进行组织学检查，以显示治疗对Ki-67和裂解的caspase-3的直接作用。有趣的是尽管没有显着趋势，但出国看病网研究人员在用Celastrol和卡铂治疗的组中观察到的神经症状较轻，后来又出现了严重的神经症状。由于肿瘤的弥漫性生长特性，在41天后停止了肿瘤生长的BLI成像，这会影响基于其迁移模式观察到的BLI信号。但是，这首先的结果体内试验与出国看病网研究人员的体外数据相结合，可作为更深入研究塞那妥和卡铂联合治疗在分子上不同的HGG模型中的疗效的基础。特别是在H3.1K27和H3.3K27突变的DIPG模型中进行更彻底的体内研究将是对此处发现的有价值的补充。
　　 总之证明FANCD2在维持pHGG细胞的基因组完整性中起着至关重要的作用，并且通过celeastrol处理降解FANCD2使HGG对卡铂介导的DNA损伤敏感。出国看病网研究人员的研究表明，HGG中FANCD2的敲低会导致复制叉停滞，从而使肿瘤细胞无法展开DNA交联。由于HGGs高度增殖，并依赖于叉子介导的DNA修复机制，出国看病网研究人员建议FANCD2作为HGGs的治疗干预的新候选者。