多形性胶质母细胞瘤是恶性神经胶质瘤的常见亚型。GBM细胞对凋亡刺激具有抵抗力，并具有异常的强大增殖和侵袭能力。在目前阶段，包括手术，放疗和化学疗法在内的综合治疗方案仍然是主流疗法。替莫唑胺是对GBM最有效的化学疗法，已显着改善了预后。然而，GBM患者的5年生存率仍然低于10％，这反映了当前治疗的疗效有限。因此，迫切需要开发用于GBM的新化学治疗剂。一旦暴露于外部或内部刺激，细胞就会通过触发内质网应激而做出反应，这有助于恢复体内平衡。内质网应激涉及多种人类疾病，包括恶性肿瘤。关于恶性肿瘤，有人提出治疗性诱导ERS诱导的细胞凋亡可能有益于杀死癌细胞。因此，内质网应激诱导可以提供预防和治疗人类恶性肿瘤的有效策略。
　　 Cinobufacini取材自蟾蜍ButorbufogarfoizansCantor的皮肤和腮腺毒液，数十年来在中国已被用作民间药，用于治疗肿胀，疼痛和心力衰竭。在过去的十年中，cinobufacini注射液还与化学治疗剂联合用于治疗肺癌，肝细胞癌，前列腺癌和胆囊癌的试验，证明了cinobufacini的抗肿瘤活性。布法地诺利德是一组cinofufacini的抗癌活性活性成分。这是在华蟾素注射液的标记化合物，已发现其具有在肝癌细胞株的抗肿瘤活性。然而，从未研究过bufothionine对GBM的作用。丁硫磷可以通过触发ER应激来促进GBM细胞凋亡。此外，丁硫磷可以与TMZ协同作用，从而抑制GBM细胞中的细胞生长。正常人星形胶质细胞购自中国科学院细胞研究所。胶质瘤细胞系U87和U373从上海生物技术和细胞生物学研究所细胞库获得，并在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中孵育。根据制造商的协议，使用从Beyotime获得的CCK-8试剂盒测定细胞活力。然后，通过分光光度计测量活细胞的吸光度。
　　 将GBM细胞悬浮在1.6毫升RPMI琼脂糖培养基中。然后将细胞铺在六孔板中，铺有一层固化的DMEM琼脂糖培养基。将细胞在37℃在5％CO2的湿润气氛中保持2周。计数直径大于0.1毫米的菌落并用NikonEclipseTE2000-U显微镜照相。使用Hoechst33258染色试剂盒进行核染色。简要地说，加入Hoechst33258来计数总细胞和死细胞。在37℃下孵育30分钟后，使用荧光显微镜检查染色的细胞。根据制造商的方案，应用凋亡试剂盒评估细胞凋亡，并使用流式细胞仪测量细胞凋亡。呈膜联蛋白V-FITC阳性的细胞被认为是晚期凋亡细胞。将细胞凋亡计算为早期和晚期细胞凋亡的总和。
　　 根据标准方案进行蛋白质印迹。在转移至聚偏二氟乙烯膜之前，将总共40ug的蛋白质样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行电泳。然后将膜用5％的脱脂牛奶封闭，并用Tris缓冲盐水-吐温溶液洗涤，然后根据制造商的指示将膜与一抗在4摄氏度孵育过夜。抗caspase-3，裂解的caspase-3，p-PERK，ATF6，p-eIF2α，Bcl-2和Bax的主要抗体购自Abcam；B-肌动蛋白被用作内部对照，购自Beyotime。山羊抗兔免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶试剂盒测量了caspase-12的活性。通过测量荧光强度来评估caspase-12的活性。根据以前发表的序列合成了靶向CHOP的shRNA寡核苷酸，并以无义序列作为对照。使用Lipofectamine3000用30nMshRNA转染细胞。转染后48小时，收集细胞用于进一步分析。除非另有说明，否则数据以平均值±SD表示，并且代表三个独立实验的结果。使用SPSS软件16.0进行所有统计分析。通过单因素方差分析和Dunnettt检验比较各组，P小于0.01被认为具有统计学意义。
　　 丁硫磷是否会影响U87和U373细胞的生存能力，需要通过CCK-8分析法进行评估。bufothionine浓度依赖性地降低了U87细胞的活力。经过24小时的处理，分别通过50和100ug每毫升的丁硫丁酸，存活的U87细胞的百分比分别降至80％和60％。处理48小时后，其分别降低至约70％和50％。U373细胞对bufothionine处理的敏感性更高。经过24小时的处理，分别通过50和100ug每毫升的丁硫氨酸，存活的U373细胞的百分比分别降至75％和50％。处理48小时后，其分别降低至约55％和40％。还通过CCK-8测定法评估了bufothionine是否影响NHA的活力，bufothionine没有显着影响活NHA细胞的百分比时NHA细胞在20，50的浓度与治疗bufothionine，和24和48小时100ug每毫升的。还检查了bufothionine是否影响菌落形成的能力。相对于对照分别用50和100ug每毫升的丁硫氨酸，U87细胞形成的集落数减少到约70％和45％。对于U373细胞，其分别降低至约45％和20％。
　　 研究了bufothionine是否激活了凋亡信号通路。在进行测定之前，先用bufothionine处理U87和U373细胞48小时。与对照组相比，U87和U373细胞中，bufothionine处理后，漂移细胞的数量显着增加，而细胞附着率显着降低。Hoechst染色法还显示，丁硫鸟碱处理可引发U87和U373细胞凋亡。膜联蛋白V-FITC染色后，通过流式细胞仪定量凋亡细胞的百分比。流式细胞术的结果表明，在U87细胞中，50和100ug每毫升布非硫氨酸可使凋亡细胞百分比分别从不到5％增加到大约10％和20％，而从少于5％增加到大约20％和30％分别在U373细胞中。还检查了bufothionine处理后caspase-3的激活。bufothionine处理浓度依赖性地降低了U87和U373细胞中caspase-3裂解的细胞内水平，而增加了caspase-3裂解的细胞内水平。此外，bufothionine处理浓度依赖性地降低了U87和U373细胞中Bcl-2的细胞内水平，而增加了Bax的细胞内水平。
　　 首先探讨了bufothionine是否能够激活caspase-12，这是ER应激的标志。bufothionine处理浓度依赖性地增加了U87和U373细胞中caspase-12的活性。然后，通过westernblot检测ER应激标志物蛋白表达的变化。bufothionine处理浓度依赖性地增加了U87和U373细胞的CHOP，PERK和eIF2α磷酸化以及ATF6的水平。总而言之，这些发现暗示bufothionine促进了U87和U373细胞中的ERS。首先通过用ER应激抑制剂Salburinal处理两种细胞系，然后进一步用bufothionine处理，来检查触发ER应激是否有助于bufothionine在U87和U373细胞中的促凋亡活性。用Sal本身预处理在U87和U373细胞系中均未引起凋亡百分比的任何变化。但是，用Sal预处理可将布非硫氨酸促进的凋亡从U87细胞中的约20％降低到小于10％，并将U373细胞中的凋亡从约30％降低到约10％。此外，Sal预处理可废除布硫丁促进caspase-3的裂解，下调caspase-3和Bcl-2的表达，并在U87和U373细胞中上调Bax的表达。ER应激也可以通过靶向CHOP的shRNA转染U87和U373细胞来阻止。单独的CHOP敲低并不会在U87和U373细胞系中引起凋亡百分比的任何明显变化。在具有CHOP敲低的U87细胞中，用100ug每毫升丁硫磷处理后的细胞凋亡百分比降至10％左右。类似地，在U373细胞，将其降至低于10％。同时，CHOP的敲除取消了U87和U373细胞中丁硫氨酸促进的caspase-3裂解，procaspase-3和Bcl-2的下调以及Bax的上调。丁硫鸟碱通过触发内质网应激促进U87和U373细胞的凋亡。
　　 在50ug每毫升和100ug每毫升的bufothionine能够显着增强TMZ的抗生长作用。为了验证是否bufothionine与TMZ协同作用，计算这两种药物之间的组合指数。使用来自生长抑制实验和CompuSyn软件的数据，得出值。CI允许对两种药物的协同作用或拮抗作用进行定量，而CI<1或CI>1分别表示协同作用或拮抗作用。bufothionine与TMZ联合在U87和U373细胞中表现出明显的协同活性。由于侵袭性和有限的治疗效果，GBM患者的预后仍然很差。自过去十年以来，人们为发现和鉴定天然存在的抗癌化合物付出了很多努力。此外，已经发现许多天然化合物对包括GBM的人类癌细胞显示出协同的抗癌活性。发现丁硫磷在GBM细胞U87和U373细胞系中激活了凋亡信号转导。从机理上讲，发现丁硫磷可以通过触发内质网应激来促进凋亡细胞的死亡。此外，出国看病网研究人员的结果表明，丁硫磷在U87和U373细胞中可与TMZ协同发挥抗生长活性。
　　 已经很好地描述了三种类型的细胞死亡：细胞凋亡，自噬和坏死。凋亡，也称为程序性细胞死亡，可以通过外部或内部触发来激活。凋亡诱导是化学治疗剂可以消除癌细胞的主要途径。关于GBM细胞，越来越多的证据表明，GBM细胞由于过度激活的生存信号和促凋亡蛋白的表达减弱而对凋亡刺激具有抗性。在本研究中，丁硫磷能够增加核染色质的密度，这表明核染色质的凝结，凝结和破碎。流式细胞仪检测还显示，bufothionine能够显着提高U87和U373细胞的凋亡细胞百分比。最终激活caspase的caspase级联反应的激活是凋亡细胞死亡的标志。bufothionine显着降低了caspase-3的细胞内水平，同时提高了caspase-3裂解的细胞内水平，表明bufothionine处理激活了caspase-3诱导了细胞凋亡。线粒体高度参与凋亡过程，线粒体的凋亡途径受到一系列促凋亡和抗凋亡蛋白的严格调控，包括Bax，Bak，Bid，Bcl-2和Bcl-xL。特别是Bax和Bcl-2之间的相互作用会导致线粒体膜破坏，随后线粒体细胞色素c释放到细胞质中，最终导致半胱天冬酶级联反应的激活。丁硫磷碱上调促凋亡蛋白Bax，而抗凋亡蛋白Bcl-2下调，这暗示线粒体功能障碍与丁硫磷促进细胞凋亡有关。该研究报道了丁苯硫氨酸通过激活线粒体凋亡信号来促进小鼠肝肿瘤细胞的细胞凋亡。
　　 内质网应激是细胞应对周围环境变化并恢复体内平衡的反应。近来，在多种癌细胞中已经建立了ER应激与程序性细胞死亡之间的联系，包括自噬和凋亡，包括黑色素瘤细胞，肉瘤细胞，胶质母细胞瘤细胞。胃癌细胞和肝细胞癌细胞。在本研究中，还发现通过特异性抑制剂或CHOPshRNA阻断ER应激可消除布菲硫醚诱导的细胞凋亡。因此，结果支持了触发内质网应激可以作为抗癌机制的想法。近来，使用天然化合物和常规化学治疗剂的组合的治疗方案已成为包括临床试验在内的研究重点。大量研究证明了天然化合物具有增强常规化学治疗剂的功效并减轻其全身毒性的能力。已发现来自医学计划的具有不同化学结构的一些天然化合物与TMZ表现出协同的抗癌活性。例如，已发现白藜芦醇可通过激活ROS依赖的AMPK-TSC-mTOR信号传导来增强TMZ在体外对GBM的抗癌活性。还发现Hispidulin是一种植物来源的类黄酮化合物，可通过激活AMPK信号传导与GBM中的TMZ协同作用。丁硫磷能够增强U87和U373细胞中TMZ的抗生长活性。而且，出国看病网研究人员的计算表明这两种作用剂协同作用。但是，需要做更多的研究来阐明潜在的机制。总而言之bufothionine可通过激活凋亡信号转导抑制体外GBM的生长。由bufothionine诱导的ER应激起上游信号的作用，促进GBM细胞凋亡。因此，出国看病网研究人员在本研究中的发现为进一步研究使用bufothionine预防和治疗GBM提供了基础。