地塞米松诱导的神经胶质瘤 |
胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤,其特征是广泛的细胞和分子异质性,可提供侵袭性扩散浸润,高生物活性以及靶向药理学标准策略的失败,在临床试验后约16个月内导致致命结果。神经胶质瘤的进展与肿瘤微环境的免疫功能受损密切相关,并归因于肿瘤与免疫细胞之间的相互干扰,以及参与生物学识别,信号传导和分泌活动的基因和相关蛋白质表达的改变。在抗肿瘤的负调节中,免疫力参与特定的细胞膜受体,这些受体通过与合适的配体相互作用而发挥抑制作用。有越来越多的证据表明,细胞表面的糖萼的异常唾液酸化是癌症的免疫原性和结果的有效免疫攻击逃避的关键调节器。唾液酸是通过a2.3,a2.6和a2.8糖苷键与糖缀合物中糖链的非还原端相连的九个碳酮糖。唾液酸在这些结构中的末端位置决定了它在免疫识别过程中对细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用的影响。
出国看病网发现,唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族成员可选择性地识别不同的连接特异性唾液聚糖,这些成员在免疫细胞中转导激活或抑制性信号传导。研究表明CD33相关的Siglecs与肿瘤唾液酸之间的相互作用可以抑制天然杀伤细胞的抗肿瘤功能,促进髓样细胞介导的癌症进展,并诱导肿瘤相关的巨噬细胞表型。尽管唾液酸-Siglec途径已被定义为一种新的抑制性免疫检查点,但尚未广泛探讨Siglecs在神经胶质瘤免疫监视中的作用。此外,有越来越多的证据,许多化学化合物包括标准治疗药物,干扰的Siglec介导的免疫力和细胞膜糖萼调制的唾液酸化图案。根据神经胶质瘤治疗的指南,地塞米松被认为是常规用于治疗肿瘤性水肿的主要类固醇。尽管具有巨大的临床潜力,但在个别神经胶质瘤患者中以特别高的临床剂量安全使用Dex仍然令人信服。如图癌症基因组图谱,地塞米松-相关基因的表达,例如,CDC25C,CDCA8,CDC20,PRC1,和PLK1,与较差的预测和患者生存期较短胶质母细胞瘤相关。此外,地塞米松降低放射疗法或替莫唑胺治疗的有效性已经被德国胶质瘤网络和欧洲组织的研究和治疗癌症中的回顾性临床研究证实了/临床试验组。尽管糖皮质激素的治疗作用机理及其对细胞生物学的调节作用是众所周知的,但对癌症免疫逃逸的潜在非基因组机理仍未完全了解。在这里目前提供的证据表明,Dex诱导的Siglec-唾液酸相互作用的变化可能参与了免疫倒置的机制。在研究中,神经胶质瘤和小胶质细胞在transwell共培养系统或单一培养物中生长,并暴露于高浓度的Dex中。在神经胶质瘤GL261细胞系中研究了Dex对a2.8连接的唾液酸表达及其合适的受体Siglec-E结合的影响,该胶质瘤在多形性胶质母细胞瘤的局部和全身免疫相互作用的实验模型中经常进行测试。
小鼠神经胶质瘤GL261细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基/F12中生长,该培养基补充了10%热灭活的胎牛血清和100ug每毫升的青霉素/链霉素。ESdM由波恩大学的HaraldNeumann教授友情提供,并在Dulbecco改良的Eagle培养基/F12中培养,该培养基含1%N2补充,0.48mML-谷氨酰胺,100ug每毫升青霉素/链霉素和15.3ug每毫升D-葡萄糖。将细胞在含有5%二氧化碳的潮湿环境中于37°C孵育。实验中使用GL261细胞和传代数介于5和15之间的ESdM。对于共培养研究,使用transwell培养系统。将幼稚的GL261细胞培养在六个孔板中,以达到80%的融合度,并将幼稚的ESdM细胞添加到置于培养皿上部的插入物中。以1:3的比例共培养细胞,但插入膜的孔大为0.4um,不允许进行物理相互作用。单养都和共培养的细胞暴露于地塞米松10uM的浓度,将其定义为较高的临床等级。暴露于Dex24小时后,通过刮取仔细收集单培养和共培养的GL261和ESdM细胞,固定在冰冷的70%甲醇中,用核糖核酸酶处理,并用碘化丙啶染色以检测DNA。量化。使用流式细胞仪通过在G0/G1,S和G2/M期中的分布来量化朴素和Dex处理过的PI荧光的分布。S+G2/M群体被量化为增殖细胞。
为了检测共培养的小胶质细胞和Dex处理对神经胶质瘤运动的影响,采用了划痕伤口试验。将GL261细胞在6孔板上的transwell系统中与小胶质细胞单培养或共培养。在约80%汇合的情况下,使用10ul移液器吸头,通过每个孔板的中心进行垂直刮擦伤口,并添加10uMDex。24小时后,通过倒置显微镜检查细胞以确定伤口面积。在暴露于Dex的0小时和24小时捕获图像,并通过ImageJ软件分析刮擦伤口中的无细胞区域。聚唾液酸是由a2.8连接的唾液酸的聚合物,在翻译后修饰过程中附着于神经细胞粘附分子。为了估计a2.8唾液酸化的水平,在与初级PSA–NCAM抗体在4°C下孵育30分钟并用适当的同种型同种异型染色后,通过流式细胞术分析GL261细胞FITC偶联抗体。根据相应的小鼠IgM同种型对照抗体确定PSA–NCAM的表达。为了研究Siglec-E受体蛋白与神经胶质瘤细胞的结合,将幼稚和Dex处理过的细胞与小鼠Siglec-E/Fc融合蛋白一起孵育,该蛋白主要识别a2.8连接的唾液酸然后用Cy3偶联的IgG二抗染色。通过流式细胞仪分析样品,并根据单独用二抗染色的阴性对照组确定融合蛋白结合的强度。为了验证Siglec-E的唾液酸依赖性结合,末端唾液酸残基的a2.3-,a2.6-和a2.8-糖苷键被a-神经氨酸酶水解。简而言之,将生长中的GL261细胞与100U每毫升a-神经氨酸酶单克隆抗体在4°C下孵育30分钟。为了确认小胶质细胞的激活状态,使用针对IL-1B和IL-10的特异性一抗研究了细胞内白介素。为了促进细胞内染色,将细胞用0.1%TritonX-100透化。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞,然后用适当的FITC偶联的二抗染色,并在BectonDickinson流式细胞仪系统上进行分析。对于每组,至少要进行3-5个独立实验。使用单向方差分析和Bonferroni后测,使用统计软件包Statistica6.0进行统计分析。结果表示为平均值±SEM。统计学差异被认为是p<0.05。
在跨孔共培养系统中用ESdM培养可以改变神经胶质瘤细胞在G0/G1和S+G2/M周期阶段的分布。G0/G1内的GL261细胞数量显着减少,从单一培养的幼稚细胞群体的61.7%降至与ESdM共培养的细胞的50.3%。相应地,S+G2M相中的细胞百分比从单一培养的胶质瘤细胞中的38.2%提高到了共培养系统中的49.7%。胶质瘤和小胶质细胞均显示出响应于Dex的细胞周期阶段分布的变化,但这些作用较弱,在单培养和共培养中均无统计学意义。在Dex对GL261增殖的影响的其他量化中,通过及时测量引起的划痕闭合来评估迁移行为。24小时后,在单培养和共培养的GL261细胞中,相对伤口宽度分别显着降低了31±3.4%和42±1.9%。与对照细胞相比,在10uMDex的存在下,单培养和共培养的伤口宽度分别减少了12±2.6%和17±1.9%。未经处理的单培养和共培养中的纯天然GL261细胞在伤口边缘显示出特定的位点定向,与它们升高的侵袭和增殖潜能密切相关。
GL261细胞与Siglec-E/Fc融合蛋白一起孵育,以建立其识别细胞表面糖萼变化的能力。对Siglec-E/Fc蛋白结合细胞的分析以人口百分比表示,证明组之间的差异。单培养和共培养的神经胶质瘤细胞均显示出与Siglec-E受体的重组胞外域相互作用的高潜力。与单培养相比,此特征在共培养的神经胶质瘤细胞中显着降低。酶促脱唾液酸化后,在两个细胞培养系统中,Siglec-E/Fc融合蛋白的结合都被显着消除,当GL261细胞暴露于Dex时。该结果与唾液酸化水平不一致。流式细胞术测定附着在NCAM上的a2.8-唾液酸显示,在单培养和共培养中,暴露于10uMDex的PSA–NCAM阳性神经胶质瘤细胞的平均相对荧光显着升高。
ESdM细胞在细胞膜中表达Siglec-E蛋白。在单培养细胞中,响应10uMDex,Siglec-E表达略有升高。在共培养物中,与幼稚细胞相比,Siglec-E的平均表达显着增加至126±4.7%。Siglec-E表达的改变伴随着通过测量细胞内细胞因子水平评估的ESdM细胞功能状态的变化。IL-1B,IL-10和小胶质细胞活化标记物Iba-1的统计分析,表示为对照组的百分比,证明了对照组和Dex治疗组之间的差异。在初次培养的ESdM细胞中,IL-1B的水平趋于降低。然而,这些变化在统计学上不明显。浓度为10uM的Dex显着降低了单培养和共培养细胞的细胞内IL-1B。相反,在暴露于Dex的单培养和共培养中,表达IL-10的ESdM细胞数量均增加。在初次共培养中,Iba-1的表达倾向于降低7%,并且对Dex的响应显着降低控件)。
Dex疗法是脑肿瘤标准治疗的一部分。尽管具有明确的临床益处,但基于Dex的神经胶质瘤管理仍包括中枢神经系统的多个陷阱,其范围从药物活性降低的药理相互作用到对大脑免疫监控的影响。先前关于Dex对神经胶质瘤细胞免疫原性影响的结果表明,这些特征与细胞膜唾液酸化有关。这是与临床观察一致认为,恶性细胞相关因素的低免疫原性与受损的免疫控制系统和更短的患者的生存期。聚唾液酸已被描述为一种至关重要的细胞膜化合物,其功能上参与细胞与细胞和细胞基质的粘附,从而促进癌症的迁移,侵袭和转移,包括脑肿瘤。考虑到与诸如Siglecs免疫受体的结合能力,唾液酸可能参与免疫调节,并促进癌细胞逃避免疫。
Siglec-E和它的人同系物的Siglec-9中发现癌细胞上并介导组织蛋白质组组成的多个改变,在宿主免疫防御的功能机制是必要的。同样,在人类肿瘤浸润性巨噬细胞中发现了Siglec-15的表达上调,但在正常组织中却没有发现,并且Siglec-11和与a2.8连接的唾液酸在大脑中的相互作用被描述为免疫应答的抑制机制。若干回顾性分析报告,大剂量地塞米松治疗是密切相关的患者的神经胶质瘤的生存降低,可能通过免疫功能较强的抑制作用。利用这些发现建立高剂量的Dex对小胶质细胞与神经胶质瘤相互作用的影响,重点是Siglec-E和唾液酸的表达。响应于Dex,GL261细胞显示出a2.8连接的多唾液酸的表达升高。尽管糖皮质激素被示出为NCAM在啮齿动物海马神经元聚唾液酸的抑制剂,和脑萎缩的诱导剂,也有越来越多的证据,在恶性细胞中的蛋白质糖基化显着地由这些试剂和特征改变与增加的唾液酸部分。然而,Dex抑制细胞生长,但延长了生存能力,这与唾液酸的改变有关,可能与神经胶质瘤细胞的高生物活性有关。另外,本研究揭示Siglec-E表达对抗炎治疗的依赖性。这与以前有关在糖皮质激素治疗中Siglecs表达改变的研究一致。从已公布的数据表明,皮质类固醇,视Siglecs的分布,可能引起通过改变抑制或激活的信号传导途径相反的效果。在过度表达Siglec-14的活跃患者中,基于糖皮质激素的疗法可引起免疫应答的不利调节,而通过ITIM偶联Siglecs产生抑制信号。可能会促进癌症的免疫逃逸。
尽管尚未完全了解这种分子机制,但抑制性西格列茨蛋白参与限制患者发展有效免疫应答的能力仍是高度可能的。Dex对单培养和共培养细胞中唾液酸-Siglec-E检查点的作用差异是这项研究的主要发现。定量流式细胞仪分析检测到共培养的神经胶质瘤和小胶质细胞分别选择性上调了PSA-NCAM和Siglec-E。假设实验是在Transwell系统中进行的,则PSA-NCAM和Siglec-E的改变独立于细胞的物理相互作用,但受地塞米松或可溶性特异性神经胶质瘤和小胶质细胞来源介体的调节,这对于调节多样性至关重要巨噬细胞/小胶质细胞表型从混合的神经胶质瘤-小胶质细胞单层培养物中获得的唾液酸聚糖-Siglec-E轴和与小胶质细胞活性相关的Siglec相关变化的估计在将来可能是一个有趣的发现。阻断抗体的参与,配体/受体的敲低和唾液酸化的调节剂可能有助于评估唾液酸和Siglec检查点对神经胶质瘤-小胶质细胞直接相互作用的免疫行为的影响。进行的Siglec-EFc嵌合体结合分析仅反映了Siglec-E可能参与了胶质瘤和暴露于Dex的小胶质细胞之间的串扰的免疫调节。巨噬细胞和小胶质细胞表现出高表型可塑性,其可响应环境刺激而改变。
另一方面,促炎或免疫抑制表型与病理类型,分期和严重程度有关。许多研究表明,在神经退行性疾病中,M1小胶质细胞在损伤部位占主导地位,并介导慢性神经炎症,而M2小胶质细胞则受到抑制。相反,恶性肿瘤浸润巨噬细胞,称为肿瘤相关巨噬细胞,主要表现出M2型,有利于肿瘤细胞的生长,存活和转移。此外,巨噬细胞响应药理刺激来调节M1/M2表型。已经证明巨噬细胞在Dex治疗后获得免疫抑制性M2表型。在研究中小胶质细胞暴露于10uMDex会增加IL10的细胞内表达,但会限制IL1B和Iba-1。在神经胶质瘤细胞的存在下,并伴随Siglec-E表达和细胞膜a2.8唾液酸化的改变,这种作用被增强。越来越多的证据表明,抑制性西格列茨蛋白与唾液酸化的恶性细胞之间的相互作用诱导了TAMs样表型,从而干扰了肿瘤微环境中的免疫监视。从CHO细胞中分离出来的粘蛋白MUC1唾液酸表位通过Siglec-9的参与对培养的原代单核细胞具有抑制作用。在腺癌A549细胞系,结肠癌LS180细胞和化学诱导的肉瘤中观察到相反的作用。这些癌症中的抑制性Siglecs限制了M2极化的表型。所呈现的差异可能与癌细胞类型和质膜糖基化模式密切相关。Siglec-唾液酸相互作用对神经胶质瘤进展的参与了解甚少。
以前的研究已经表明,胶质母细胞瘤活检含有多达其显示免疫抑制表型噬细胞的50%。在这些肿瘤中,NCAMs的a2.8唾液酸化与进展的潜力和预后较差密切相关。从新鲜胶质瘤组织中分离。此外,髓源抑制细胞表达的Siglec-3,的Siglec-5,的Siglec-7,和的Siglec-9的基因和蛋白水平。为了模拟天真和Dex处理的细胞中Siglec-E和唾液酸表位之间的相互作用,分析Siglec-E/Fc蛋白对GL261细胞的亲和力。尽管证实了Dex诱导的唾液酸化,但单培养的神经胶质瘤细胞中Siglec-EFc/Fc蛋白的结合减少。在共培养的细胞中该过程大大减少,但是对Dex的反应却增加了。仍然需要更好地了解这些过程并进一步研究它们的机制。目前的数据表明,基于Dex的治疗作为抗肿瘤治疗的一部分,可以通过ITIM偶联的Siglecs与唾液聚糖之间的相互作用对抗肿瘤宿主免疫产生有害影响。提出的假设可能有助于确定糖皮质激素在胶质瘤中固定小胶质细胞中的作用,并反映出需要通过改变Siglec受体及其唾液酸化受体配体的功能来激活免疫监视。在脑肿瘤治疗中考虑Siglec受体调节M1/M2表型可以减少与Dex相关的危险因素,并改善生存预后。将来,它可能是与癌症相关的免疫抑制的重要治疗方向。
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