胶质母细胞瘤是中枢神经系统的高度恶性肿瘤，占所有原发性脑肿瘤的23％和所有胶质瘤的50％。尽管在过去的几十年中，胶质母细胞瘤的诊断和治疗取得了巨大的进步，但胶质母细胞瘤仍然无法治愈，而且预后往往很差。胶质母细胞瘤的治疗策略包括手术，放疗和化学疗法。然而，治疗策略仍然有限，因为成胶质细胞瘤的发病机理尚未完全了解。能量代谢重编程是癌症的十大特征之一。正常细胞在有氧条件下通过氧化磷酸化来代谢葡萄糖，在无氧条件下有利于糖酵解，而Warburg发现，即使在有氧条件下，癌细胞也主要依靠糖酵解。这种现象被称为Warburg效应，并且是用于癌细胞的增殖非常重要。有氧糖酵解是在胶质母细胞瘤主要能源资源。更好地了解胶质母细胞瘤中有氧糖酵解的机制将有助于为该疾病开发更有效的治疗策略。
　　 长非编码RNA是一类RNA转录物，长度超过200个核苷酸，但不会翻译成蛋白质。据估计，人类中有数千个LncRNA，但由于水平低，可能只有一小部分具有生物学功能。这些LncRNA可以在基因上进行顺式或顺式交易，并具有生物学功能，例如基因印迹和反义调控。越来越多的证据支持LncRNA参与癌症的各种生物学过程，调节细胞增殖，凋亡和转移。此外，LncRNA还可以调节癌症中的葡萄糖代谢。例如，发现LncRNAUCA1增强膀胱癌细胞的糖酵解作用，而LncRNAPVT1可以促进骨肉瘤的糖酵解作用。小核仁RNA宿主基因9是膜脂相关的LncRNA，被发现可调节胰腺癌细胞的增殖。但是，尚不清楚SNHG9在胶质母细胞瘤中的作用。
　　 微小RNA是一类小的非编码RNA，通过与DNA，RNA或蛋白质相互作用而发挥生物学功能。发现几种miRNA和LncRNA之间的直接交叉调节可促进肿瘤发生。在几种癌症中发现了miR-199a-5p表达水平的改变。在高级脑干神经胶质瘤组织中，miR-199a-5p的表达明显低于正常脑组织和低度脑干神经胶质瘤组织中的表达，在脑干神经胶质瘤中miR-199a-5p的表达降低。导致Wnt2途径的异常激活。通过生物信息学分析，在SNHG9上发现了可能的miR-199a-5p结合序列。因此，海外医疗网研究人员旨在研究SNHG9在调节Wnt2轴方面的潜在作用以及在胶质母细胞瘤中的作用。
　　 从医院的40例脑胶质瘤患者中收集脑胶质瘤组织和附近的非肿瘤组织。切除后，将一部分样品用于组织学诊断，另一部分样品在液氮中冷冻以备进一步研究。没有患者在手术前接受过放疗或化疗。将人神经胶质瘤细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM中培养。正常人星形胶质细胞被用作对照并保持在相同的条件下。在所有这些神经胶质瘤细胞系中均测量了SNHG9和miR-199a-5p的表达水平。对于其他实验，由于研究人员旨在研究SNHG9和miR-199a-5p对胶质母细胞瘤的影响，选择使用U87和U251，这是两种来自WHOIV级胶质母细胞瘤的常用胶质母细胞瘤细胞系。
　　 根据qRT-PCR的结果，将患者分为2组：SNHG9高表达组和SNHG9低表达组。在5年的随访中计算了总生存期和无进展生存期。显示SNHG9表达与这些肿瘤组织的临床病理特征的关系。此外，为了检测这些因素是否独立于较差的总生存期或无进展生存期，进行单因素和多因素Cox比例风险回归分析。结果表明，SNHG9是整体生存不良的独立预后因素和无进展生存期较差。用这些慢病毒载体感染U87和U251细胞，然后选择适当的抗生素以获得稳定转染的细胞。miR-199a-5p的模拟物和抑制剂以及阴性对照。用表达SNHG9的质粒，SNHG9shRNA，miR-199a-5p模拟物或抑制剂转染U87和U251细胞。48小时后收获细胞。通过蛋白质印迹法测量SNHG9，miR-199a-5p和Wnt2的mRNA水平，并测量Wnt2的蛋白质水平。
　　 为了测量细胞活力，将U87和U251细胞在96孔板中以5000个细胞进行培养。用指定的质粒或miR-199a-5p模拟物或抑制剂转染后，将10％CCK8添加到培养基中。每隔24小时用10％CCK8的新鲜培养基替换培养基4次。最后一次更换培养基后三小时，在450nm处测量每个孔的吸光度。将细胞在5000孔的96孔板中培养，并用指定的质粒或miR-199a-5p模拟物或抑制剂转染。48小时后，使用核小体ELISA试剂盒按照手册指导评估细胞的凋亡。用指定的质粒或miR-199a-5p模拟物或抑制剂转染细胞。转染后48小时，使用葡萄糖测定试剂盒，收集每个孔的5ul培养基并用于测量葡萄糖浓度。使用乳酸测定试剂盒以相同的方式测量乳酸的浓度。
　　 糖酵解压力测试是使用商业SeahorseXF糖酵解压力测试套件按照手册中的规程进行的。该方法细胞外酸化率反映了糖酵解的关键参数。通过在miRcode和RNAhybrid的数据库中进行搜索，可以预测SNHG9通过某个序列与miR-199a-5p结合。含有该序列或相应突变序列的SNHG9cDNA被扩增并克隆到萤光素酶报告载体psiCHECK2中。将U87和U251细胞与指定的报道载体和miR-199a-5p模拟物或抑制剂共转染。48小时后，使用双重荧光素酶报告系统检测到荧光素酶活性。由MEXNbio，Co.合成的SNHG9生物素标记的DNA探针，生物素标记的SNHG9和反义RNA探针。将来自U251细胞的裂解物与生物素标记的DNA或RNA混合，并在室温下孵育1小时。然后将抗生蛋白链菌素-琼脂糖珠添加到混合物中以分离RNA。通过qRT-PCR测量回收的RNA。转染后48小时，使用放射免疫沉淀裂解缓冲液裂解细胞。蛋白质提取物经过标准的蛋白质印迹程序。一抗是：AntiWnt2，抗B-肌动蛋白。辣根过氧化物酶偶联的二抗和电化学发光试剂用于可视化条带。数据显示为平均值±SD。当有2组时使用学生t检验，在有2组以上时使用单向ANOVA。生存率通过Kaplan-Meier分析进行分析。单因素和多因素Cox比例风险回归分析用于评估SNHG9的表达以及与神经胶质瘤总体存活率相关的其他临床病理特征。通过Pearson的R相关分析评估了不同基因水平之间的相关性。
　　 人脑胶质瘤组织中SNHG9mRNA的表达明显高于非肿瘤组织。此外，神经胶质瘤细胞显示出比正常星形胶质细胞NHAs高得多的SNHG9表达。Kaplan-Meier分析发现总体生存期以及无进展生存期SNHG9高表达的神经胶质瘤患者明显低于SNHG9低表达的神经胶质瘤患者。高水平的SNHG9与晚期肿瘤，较大的肿瘤大小和转移相关。这些结果提示SNHG9在胶质母细胞瘤中的作用。因此，在下面的体外实验中，选择了U87和U251细胞系，它们是2种最常见的且具有代表性的源自WHOWHOIV级胶质母细胞瘤的胶质母细胞瘤细胞系。SNHG9表达与IDH状态之间无显着相关性。
　　 在U87和U251细胞与SNHG9的shRNA转SNHG9的mRNA表达显着高于用空载体，表明这些shRNA有效地下调了SNHG9的表达。SNHG9shRNA显着抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。SNHG9的下调导致葡萄糖水平升高和乳酸水平降低在培养基中，提示葡萄糖消耗减少。通过SNHG9shRNA的转染减少了培养基的酸化，这可以通过培养基的颜色目视观察到。这通过糖酵解压力测试得到证实，其中ECARs值显示，通过转染SNHG9shRNA，基础糖酵解和最大糖酵解能力均降低。用SNHG9shRNA转染细胞时，U87和U251细胞中miR-199a-5p的mRNA水平显着升高，而用表达SNHG9的质粒转染细胞时，miR-199a-5p的mRNA水平下调。这两个基因之间的相互作用。使用miRcode和RNAhybrid的数据库，预测了SNHG9上miR-199a-5p的假定结合位点。萤光素酶测定的结果表明，miR-199a-5p抑制了SNHG9的萤光素酶活性，但不抑制SNHG9的突变，表明SNHG9与miR-199a-5p通过此结合位点发生了相互作用。通过生物素下拉测定法进一步证实了这种结合，其中发现内源性SNHG9和体外合成的SNHG9均可拉低miR-199a-5p。此外，相关性分析显示，胶质母细胞瘤组织中SNHG9与miR-199a-5p之间存在显着的负相关性。综上结果表明，SNHG9可以结合并抑制成胶质细胞瘤中的miR-199a-5p。
　　 人神经胶质瘤组织显示出miR-199a-5pmRNA表达明显低于非肿瘤组织。此外，神经胶质瘤细胞显示出比正常星形胶质细胞NHAs低得多的miR-199a-5p表达。当用miR-199a-5p模拟物转染细胞时，miR-199a-5pmRNA表达显着升高，而当用miR-199a-5p抑制剂转染细胞时，miR-199a-5pmRNA表达降低，这表明这些模拟物的有效性。或抑制剂。因为Targetscan数据库在Wnt2的3'UTR上预测了miR-199a-5p结合位点，进行萤光素酶测定。结果表明，miR-199a-5p的过表达降低了Wnt23'UTR荧光素酶的活性，而抑制miR-199a-5p则增强了Wnt23'UTR荧光素酶的活性。miR-199a-5p模拟物显着增加了Wnt2表达，而miR-199a-5p抑制剂则显着降低了Wnt2表达。相关分析显示，在人脑胶质瘤组织中，Wnt2水平与miR-199a-5p水平之间存在显着的负相关，而Wnt2水平与SNHG9水平之间存在正相关。这些数据表明，miR-199a-5p可以下调胶质母细胞瘤中的Wnt2。
　　 SNHG9显着提高了U87细胞中Wnt2的mRNA表达和蛋白质水平，miR-199a-5p可以减弱SNHG9的作用。用表达SNHG9的质粒转染的U87细胞显示出增加的细胞活力，细胞凋亡减少，葡萄糖水平降低，培养基中乳酸水平升高，增强基础糖酵解和最大糖酵解能力。miR-199a-5p模拟物的共转染可以减弱SNHG9的所有这些作用。这些结果表明，Wnt2参与了SNHG9在胶质母细胞瘤中的作用。
　　 早就知道LncRNA参与致癌作用。SNHG9是已在胰腺癌和乳腺癌组织中。然而，到目前为止，尚不清楚SNHG9在致癌作用中的作用。在研究中，研究人员调查SNHG9是否参与了胶质母细胞瘤的发病机理。发现，与非肿瘤组织和正常星形胶质细胞相比，人神经胶质瘤组织和胶质母细胞瘤细胞系中SNHG9mRNA的表达显着升高。此外，发现SNHG9的表达升高与神经胶质瘤患者的晚期分级和较低的存活率有关，这表明SNHG9参与了胶质母细胞瘤的发病机理。因此，在U87和U251细胞系中进行了体外实验，U87和U251细胞系是源自WHOWHOIV级胶质母细胞瘤的2种最常用和最具代表性的胶质母细胞瘤细胞系。
　　 Warburg效应是癌症的十大标志之一。尽管有氧糖酵解产生能量的效率比正常细胞中的线粒体氧化磷酸化的效率低得多，但它是癌细胞的主要能量来源。同时，有氧糖酵解可以产生几种糖酵解中间体，这些中间体对于肿瘤生长和增殖所需的大分子的生物合成是必不可少的。此外，有氧糖酵解的主要产物乳酸可激活VEGF，从而刺激肿瘤血管生成。在研究中检查了SNHG9对胶质母细胞瘤细胞葡萄糖代谢的影响。发现，胶质母细胞瘤细胞中SNHG9的过表达增加了细胞增殖并增强了有氧糖酵解，导致培养基中乳酸水平增加，反之亦然。研究人员的结果表明SNHG9参与胶质母细胞瘤的发病机理可能是通过其促进有氧糖酵解和细胞增殖的作用来实现的。
　　 然后，研究胶质母细胞瘤中SNHG9作用的潜在机制和途径。miRNA是一类小的非编码RNA，通过与DNA，RNA或蛋白质相互作用而发挥生物学功能。越来越多的证据表明，miRNA和LncRNA之间存在功能相互作用。发现几种miRNA和LncRNA之间的功能相互作用与肿瘤发生有关。在研究中确定SHNG9的目标miRNA。使用miRcode和RNAhybrid数据库，预测SNHG9可能通过某个结合位点与miR-199a-5p相互作用。荧光素酶测定法和生物素下拉测定法的结果证实了这一预测。SNHG9可能下调胶质母细胞瘤细胞中miR-199a-5p的水平。揭示了人类神经胶质瘤组织中SNHG9与miR-199a-5p之间的负相关。由于miR-199a-5p已在癌症的发展和进展中得到了充分证明，因此SNHG9在胶质母细胞瘤中的作用可能是通过涉及miR-199a-5p的途径进行的。
　　 接下来，进一步探索SNHG9的可能下游靶标。Wnt信号通路在各种癌症的进展中起着重要作用。使用Targetscan数据库，在Wnt2的3'UTR上发现了miR-199a-5p结合序列。结果表明，miR-199a-5p可以下调Wnt2。结果与先前的研究一致，后者也发现miR-199a-5p可以直接抑制Wnt2表达并抑制平滑肌细胞和成骨细胞中的细胞增殖。已知Wnt2可以激活Wnt途径来调节细胞增殖。此外，所述Wnt的信号还发现通过作用于几种酶和调节与代谢。因此，推测Wnt2参与了SNHG9在胶质母细胞瘤细胞增殖和有氧糖酵解中的作用。与这种推测一致的是，体外研究的结果表明SNHG9可以增加Wnt2表达，而miR-199a-5p减弱了这种作用。miR-199a-5p也减弱了SNHG9在促进U87胶质母细胞瘤细胞中需氧糖酵解和细胞增殖方面的作用。这些发现支持SNHG9在胶质母细胞瘤细胞增殖和有氧糖酵解中的作用可能是通过下调miR-199a-5p和上调Wnt2。但是，尚不清楚SNHG9的详细机制和下游目标。表达SNHG9的质粒在U87细胞中的转染过于简单，无法模拟胶质母细胞瘤中SHNG9的表达。因此，需要进一步的体内研究来证实这种推测。总之，研究人员的研究确定了SNHG9轴在胶质母细胞瘤中的作用。SNHG9可以促进有氧糖酵解和胶质母细胞瘤细胞增殖，这种作用可能是通过下调miR-199a-5p，然后上调Wnt2来实现的。