神经胶质瘤是常见的恶性肿瘤 |
胶质瘤是世界范围内的常见恶性肿瘤,并且是因癌症死亡的第六大最常见原因。胶质瘤经常在确诊的晚期阶段,中国是高风险的神经胶质瘤的地区之一。胶质瘤患者的预后尚未得到很好的改善。阐明神经胶质瘤的发生和发展过程中关键途径的详细相互作用和调控机制,并为早期发现和诊断找出分子标记非常重要。环状RNA是一类特殊的非编码RNA,具有共价环结构。第一circRNA是在20世纪70年代发现的,至今被认为是转录的副产品,与高通量测序的来临,各种circRNAs已经在具有高稳定性和保护人类基因组中发现。circRNA可以作为一个竞争的内源RNA通过揩微RNA,以调节基因表达。例如,hsa_circ_0001946通过影响信号传导来促进肺腺癌细胞的生长。在神经胶质瘤中,circ_0034642可通过靶向miR-1205促进细胞进程来提高BATF3水平。另一出版物指出,hsa通过调节显着提高了神经胶质瘤的进展。关于circRNA在神经胶质瘤肿瘤发生和发展中的作用的研究仍在进行中。circ_0079593是最近发现的与神经胶质瘤相关的circRNA,在circRNA芯片筛选的肿瘤组织中被上调circ_0079593映射到chr7。其基因符号为IGF2BP3,剪接长度为262bp。海外医疗网研究人员旨在研究circ_0079593在不同神经胶质瘤细胞系中的表达及其在神经胶质瘤的发生,发展过程中的功能。首先在60对神经胶质瘤肿瘤样品和相应的正常组织中测量circ_0079593的表达谱。通过定量实时聚合酶链反应在U118,U251,U87MG和LN229细胞系以及正常人星形胶质细胞系NHA中进一步分析其表达。为了观察circ_0079593在神经胶质瘤中的功能,通过细胞转染下调或上调了其水平。还研究了circ_0079593的临床意义。评估细胞增殖,迁移,侵袭能力以及凋亡。还分析了这些监管措施背后的机制。circ_0079593可能是神经胶质瘤的新标志物和治疗靶标。
在这里,从医院收集了60对新鲜冷冻的神经胶质瘤和正常组织。手术切除后的所有标本均立即置于-80°C下进行保存。胶质瘤细胞和正常人星形胶质细胞细胞系NHA均在Dulbecco改良的Eagle培养基或RoswellParkMemorialInstitute1640培养基中培养,其中含10%胎牛血清并保持在细胞培养箱。通过TRIzol试剂分离总RNA。使用SYBRSelectMasterMix试剂盒通过qRT-PCR评估circRNA和miRNA的表达水平,并将甘油醛3-磷酸脱氢酶用作内标。转染的细胞在96孔板中培养,每孔2×10细胞。每天间隔将10微升细胞计数试剂盒8试剂供应到培养基中,再孵育2小时。然后,通过酶标仪在450nm处测量光密度值以估计细胞活力。用流式细胞仪测量细胞凋亡。在悬浮于400μL的1x结合缓冲液中后,细胞系用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶在黑暗中放置10分钟。通过流式细胞仪检测荧光的表达。通过伤口愈合测定法测试细胞迁移能力。将LN229和U251细胞系在2.5厘米培养皿中用无血清培养基培养。之后,用无菌移液器吸头产生划痕。48小时后,拍摄了每个孔的划痕并对其面积进行了分析。
细胞转移特性是通过使用具有8μm孔的单元进行评估的。将在完全培养基中培养的转染细胞添加到上层隔室。将具有10%FBS的600微升完全培养基填充到匹配的下部隔室中。温育后24小时,清除保留在上腔室中的细胞。将穿过滤膜的已迁移的细胞用低聚甲醛固定,用结晶紫染色并拍照。将细胞与WT或Mutcirc_0079593报告质粒以及模拟物或mimics-NC共转染。转染后36小时,根据制造商的说明,通过荧光素酶报道试剂盒测量荧光素酶活性。本研究中的所有数据均通过GraphPadPrism5.01和SPSS22.0进行分析,并表示为均值±SD。使用t检验或单因素方差分析对两组进行比较。通过Fisher精确检验,Kaplan–Meier分析和Cox回归分析评估临床意义。
为了揭示circ_0079593在神经胶质瘤中的功能,研究人员首先评估了circ_0079593在神经胶质瘤组织中的水平。CIRC_0079593的表达相对于相邻的样品。发现与NHA细胞系相比,所有已登记的细胞系circ_0079593均得到增强。接下来,研究circ_0079593在神经胶质瘤患者中的临床价值。研究人员根据神经胶质瘤组织中circ_0079593的平均值将患者分为两组。高circ_0079593表达在患者中经常观察到的具有较大的肿瘤大小和更高等级的WHO。circ_0079593水平高的神经胶质瘤患者的生存率比circ_0079593高表达的神经胶质瘤患者差。多变量分析显示circ_0079593作为独立的预后指标。以上结果表明,circ_0079593是神经胶质瘤中重要的circRNA失调,其升高可能与肿瘤的进展有关。将两种siRNA应用于敲除circ_0079593最高水平的LN229细胞系中circ_0079593的水平。结果,击倒效率良好。研究人员还构建了载体,以提高circ_0079593在U251细胞株中的表达。在U251细胞中,circ_0079593的表达明显增加了20倍。在功能上,检测细胞增殖,凋亡和转移特性以测量circ_0079593的功能作用。CCK-8分析表明,沉默的circ_0079593相对于转染si-NC的LN229细胞明显降低了细胞活力。circ_0079593的过表达促进了U251细胞的活力。此外,在LN229和U251细胞系中,细胞凋亡率也与circ_0079593表达负相关。为了检测circ_0079593是否可能影响细胞转移特性,进行了伤口愈合和Transwell实验。两个siRNA均敲低circ_0079593可以显着抑制LN229细胞迁移。相反,过表达的circ_0079593增强了U251细胞系中的细胞迁移潜能。Transwell迁移分析表明了相似的结果。Transwell侵袭实验表明,沉默的circ_0079593显着损害LN229细胞的侵袭能力。相反,异位表达的circ_0079593在U251细胞系中引起相反的作用。
萤光素酶报告基因检测表明,miR-182或miR-433的升高显着降低了野生型载体的萤光素酶强度,但对突变型载体没有影响,表明circ_0079593序列上的“UGCCAA”和“AUCAUGA”基序是针对circ_0079593的miR-182和miR-433的作用位点。
对LN229和U251细胞系进行了抢救实验,以检测circ_0079593的生物学作用是否取决于其对miR-182和miR-433的衰减。qRT-PCR结果表明沉默的circ_0079593在LN229细胞中显着提高了miR-182和miR-433的表达。但是,这种增强可以在抑制剂共转染组中得以挽救。异位表达的circ_0079593抑制了U251细胞系中的miR-182和miR-433水平。同时,与circ_0079593载体和miR‐182或miR‐433模拟物共转染后,miR‐182和miR‐433的水平分别得以恢复。而且,由circ_0079593耗竭引起的细胞活力和侵袭下调可以通过LN229细胞系中的miR-182和miR-433抑制剂部分挽救。此外,在si-circ_0079593,miR-182抑制剂和miR-433抑制剂共转染的细胞组中,致癌功能几乎完全恢复。circ_0079593载体促进的U251细胞生长和侵袭可能被miR-182或miR-433模拟物显着阻断。在用circ_0079593载体,miR-182模拟物和miR-433模拟物共转染的细胞中,进一步抑制了致癌功能
circRNA与许多人类疾病的致癌性和发展有关。到目前为止,有侧重于神经胶质瘤和circRNAs之间的关联没有报道circ_0079593的任何疾病中的作用。其基因符号为IGF2BP3,剪接长度为262bp。确定了它在神经胶质瘤组织和细胞系中的上调。circRNA具有被用作癌症患者预后生物标志物的潜力已被广泛接受。发现circ_0079593的升高与更大的肿瘤大小和更先进的WHO等级紧密相关。通过Kaplan–Meier分析分析,circ_0079593水平高的神经胶质瘤患者的生存时间较短。多变量分析显示circ_0079593是神经胶质瘤患者的独立预后指标。提示circ_0079593是潜在的标志物,将有助于神经胶质瘤的预后预测。通过概述和评估临床标本,包括60例神经胶质瘤患者的肿瘤组织和肿瘤邻近组织,进一步鉴定和探索了circ_0079593在神经胶质瘤发病中的功能。这项工作表明circ_0079593的过表达可以促进神经胶质瘤细胞的生长,迁移和侵袭。同时,circ_0079593的过表达抑制了胶质瘤细胞的凋亡。当circ_0079593的表达被siRNA抑制时,上述所有这些肿瘤细胞的侵袭特性均被削弱。结果首次证明circ_0079593可能在这种致死性疾病的肿瘤发生和发展中起着至关重要的作用。
对于机制探索,发现circ_0079593可通过使miR-182和miR-433变海绵促进神经胶质瘤的进展。miR-182表达在包括胃癌,乳腺癌,肝细胞癌,结肠直肠癌和膀胱癌在内的人类癌症中降低与miR-182也可以在转录后水平调控。例如,有出版物指出,较长的非编码RNAPCAT19可以通过调节信号传导来促进喉癌细胞的生长。对于的miR-433揭示了miR‐433通过靶向Rap1a影响丝裂原激活的蛋白激酶信号通路来抑制乳腺癌细胞的进程。miR-433可以被CREB1激活,并减弱大肠癌的传播和转移活性。发现神经胶质瘤中miR-182和miR-433降低。救援分析表明,由circ_0079593引起的致癌作用已被miR-182和miR-433部分消除,这表明miR-182和miR-433是circ_0079593的重要介体。数据表明circ_0079593是miR-182和miR-433的上游负调节剂,并通过靶向神经胶质瘤中的这两个miRNA充当癌基因。这项研究存在一些局限性。由于仅靠体外实验不能完全解释cirRNA的功能,因此需要进行动物实验。因此,组合式小鼠模型可以提高这一结论的可信度。研究人员共同研究了circ_0079593的潜在机制,发现在神经胶质瘤中miR‐182和miR‐433可以被circ_0079593吸收和调节。circ_0079593的临床和功能意义,并阐明调控网络在神经胶质瘤进展中的重要作用。
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