长非编码促进胶质瘤细胞凋亡 |
胶质瘤被认为是中枢神经系统中发生的最常见和恶性的脑肿瘤,并且其具有高复发率和死亡率。其中,胶质母细胞瘤被认为是最具侵袭性的亚型,5年生存率不超过5%。根据其组织病理学特征,鉴于恶性程度,胶质瘤可归类为低级别胶质瘤和高级别胶质瘤。目前,手术摘除,局部照射以及常规化疗等多种治疗方法取得了很大进展,而胶质瘤患者的病死率在诊断后2年仍然很高。为了找到有用的诊断标志物和有效治疗靶点的胶质瘤进展中复杂的基因相互作用和分子调节网络,人们也做出了巨大努力。然而,该机制仍处于起步阶段,更好地认识参与胶质瘤形成和发展的分子机制对于突出潜在的治疗靶点和寻求治疗胶质瘤的策略具有重要意义。
已经证明长的非编码RNA涉及许多重要的细胞过程,例如细胞增殖,迁移,侵袭和凋亡。越来越多的证据暗示lncRNA的失调常常在不同类型的肿瘤中发现并导致肿瘤进展和侵袭。在阿霉素诱导的胶质瘤细胞系坏死中lncRNATUG1被下调lncRNAH19的下调抑制了G胶质瘤细胞的致瘤性和干性。lncRNAMT1JP位于16号染色体上的簇中,该簇由金属硫蛋白家族中的一些同源蛋白质编码基因组成。MT1JP基因座还注释了几个CpG岛,单核苷酸多态性,以及DNase超敏感位点簇,已经确定MT1JP似乎在抑制肿瘤中发挥重要作用,表明MT1JP相对于相应的正常组织在肿瘤组织中具有降低的表达。MT1JP在神经胶质瘤中的作用仍有待揭示。磷酸酶和张力同源物被称为肿瘤抑制因子,其表达在一些人类肿瘤中被下调。PI3K信号传导途径是在肿瘤发生的调节中起作用的途径,并且其在神经胶质瘤中显着活化。在此基础上,海外医疗网的研究人员进行了这项研究,通过调节PTEN信号通路,研究了lncRNAMT1JP在胶质瘤细胞生物学性质中的作用。
人神经胶质瘤细胞系U87,U251和SNB19购自美国型培养物保藏中心。将神经胶质瘤细胞系U87,U251和SNB19在含有10%新生小牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养,将其在37℃下培养5小时CO2培养箱。处于对数生长期的细胞用于后续实验。
MT1JP过表达质粒和MT1JP干扰质粒。选择Neo作为MT1JP干扰质粒的克隆载体。用QIAGEN质粒提取试剂盒提取MT1JP过表达质粒和MT1JP干扰质粒。通过NanoDropND-2000检测DNA的纯度和浓度:当纯度被认为满足OD260范围内的要求时,可以进一步使用质粒。在转染前的第一天,将胶质瘤细胞在不含抗生素的培养基上铺在6cm培养皿中。培养16小时后,通过显微镜观察细胞密度达到80-90。在转染当天,将MT1JP过表达质粒,干扰质粒和相应的阴性对照质粒加入到不含抗生素和血清的500ul培养基中。将Lipofectamine2000和比例为1:1的质粒加入500ul无血清和无抗生素的培养基中以充分混合。将混合物置于室温下分解5分钟。将含有MT1JP过表达质粒,MT1JP干扰质粒a,d脂质体转染试剂的混合物混合并孵育。神经胶质瘤细胞被分配到空白组。
收集转染的细胞用于制备单细胞悬浮液。根据细胞计数将细胞密度调节至5×104细胞每毫升,并将细胞接种于96孔板中,每组配备6个平行孔。将培养板在培养箱中预培养,然后向没有光的每个孔中加入CCK-8溶液。将培养板在37℃下孵育3小时,并使用酶联免疫吸附测定测定波长450nm处的吸光度值。细胞活力是指含有CCK-8溶液,细胞但没有药物溶液的孔的吸光度值;A代表含有CCK-8溶液,培养但没有细胞的孔的吸光度值;A对应于含有CCK-8溶液,细胞和药物溶液的孔的吸光度值。重复该实验一式三份。根据1×10将细胞接种到六孔培养板中细胞。细胞粘附后,细胞同步培养12小时,除去原始培养基并进行相应的处理一段特定时间。分离细胞后通过离心收集细胞,将细胞用预冷的75%乙醇重悬浮并在-20℃下固定过夜。离心后弃去上清液。在每个样品中,使用450ul磷酸盐缓冲盐水悬浮细胞,然后加入50ul碘化丙锭,然后在37℃水浴中放置30分钟。离心后再次弃去上清液。通过流式细胞仪测量和分析细胞周期分布。将转染的细胞补充至预冷的1x结合缓冲液。向细胞悬浮液中加入5ul膜联蛋白-V-FITC和2.5ulPI并轻轻混合。通过流式细胞仪检测细胞凋亡。在散点图中,左下象限显示健康的活细胞,右下象限显示早期凋亡细胞,右上象限显示坏死和晚期凋亡细胞。凋亡率=早期凋亡百分比+晚期凋亡百分比。该实验独立重复三次。
转染48小时后,将细胞在无血清DMEM培养基上饥饿12小时。将细胞浓度调节至1×10细胞每毫升,并在每个侵入室中加入100ul细胞悬浮液。每个侵袭室的基底外侧室补充有含有10%胎牛血清的60ulDMEM培养基。对于Transwell侵袭测定,将基质胶在无血清DMEM培养基中稀释至细胞接种于室中的前一晚。在Trasnwell迁移试验中没有补充基质胶。将室在含有5%CO2的培养箱中温育在37℃下,迁移试验在侵袭试验28小时后持续20小时。将室用90%乙醇固定,用0.1%结晶紫溶液染色并在显微镜下观察。在光学显微镜下随机拍摄六个视野以计算细胞总数。
六孔板的背面垂直于水平轴,并且每0.5-1.0cm间隔用标记物标记。将基于对数生长期24小时无血清处理的细胞接种到6孔板中,基于5×10细胞孔的数目。当细胞达到90%汇合时,使用垂直于板的枪头沿着标记线划伤细胞。用PBS洗涤细胞两次以洗掉划伤的漂浮细胞。向细胞中加入McCoy's5a培养基并置于含有5%CO2的培养箱中在37℃。照片在倒置显微镜下在0和24小时拍摄。使用图像工具软件计算愈合面积,其计算为初始划痕的宽度值×100%。从细胞中提取总蛋白,用二辛可宁酸蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度,调整各组蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞,转移,加入5%脱脂奶粉并在4℃下密封过夜。
50只6周龄雌性BALB无胸腺裸鼠。将它们随机分为5组:空白组,pEGFP-NC组,pEGFP-MT1JP组,shRNA-NC组和pGPU6-MT1JP-shRNA组。裸鼠的繁殖条件严格控制,恒温,环境无任何病原体。在接种前将肿瘤升高约一周。分离和转染后,将每组细胞在1,000rpm离心5分钟洗涤两次。收集细胞并与稀释的高浓度基质胶混合。共5×107通过皮下注射将细胞接种在裸鼠的左腋窝中。每天给裸鼠注射细胞以观察裸鼠的生长以称重裸鼠。每5天使用游标卡尺测量肿瘤的大小。进行实验记录,通过数据处理描述肿瘤生长曲线。40天后,通过CO2吸入使裸鼠安乐死,测量肿瘤体重和大小并估计肿瘤体积。
独立地一式三份地重复实验。测量数据表示为平均值和标准偏差。所述吨试验用于分析组间差异。实施单向方差分析以分析三个或更多组之间的差异。枚举数据通过率或百分比,并表示χ2采用测试进行分析。采用Kaplan-Meier法获得患者的生存曲线,采用对数秩方法得到不同表达水平患者的生存率差异。多变量Cox回归用于预测临床参数的预后意义。在所有分析中使用双侧分析,并且在p小于0.05中观察到显着差异。
定量逆转录聚合酶链反应是用于测定神经胶质瘤组织和细胞中MT1JP表达的方法。结果表明正常脑组织中MT1JP的表达高于胶质瘤组织。还检测MT1JP表达在三种人神经胶质瘤细胞系中发现U87,U251,和SNB19和MT1JP的最高表达SNB19细胞中发现,最低在U87细胞。MT1JP表达与胶质瘤组织的临床病理学特征之间的关系。根据胶质瘤组织中MT1JP的中位表达,将胶质瘤患者分为MT1JP高表达组和MT1JP低表达组。结果提示MT1JP表达与脑胶质瘤的WHO分级和生存时间显着相关。在年龄,性别,肿瘤分布,KPS评分和肿瘤直径的表达之间未发现关联。通过Kaplan-Meier方法估计MT1JP表达与神经胶质瘤患者存活时间之间的关系。根据138例患者的生存曲线,MT1JP高表达的胶质瘤患者的总生存时间明显长于MT1JP低表达的患者。
海外医疗网研究人员通过CCK-8测定进一步检测了MT1JP对人脑胶质瘤细胞系U87增殖的影响。MT1JP过表达质粒的转染后,神经胶质瘤细胞的增殖能力显著抑制,而MT1JP干扰质粒的转染后,神经胶质瘤细胞的增殖能力显著促进。空白组,pEGFP-NC组和shRNA-NC组胶质瘤细胞增殖能力差异无统计学意义。结果表明,过表达可抑制胶质瘤细胞的增殖,敲除MT1JP基因可明显增强胶质瘤细胞的增殖活性。通过流式细胞术比较各组中神经胶质瘤细胞的细胞周期变化。与空白组相比,pEGFP-NC组和shRNA-NC组细胞周期分布无差异;pEGFP-MT1JP组细胞周期分布明显改变,G0期细胞停滞,S期和G2期细胞停滞较少;pGPU6-MT1JP-shRNA在G0期停滞的细胞较少,S期和G2期的细胞较多。
每个组中的神经胶质瘤细胞的细胞凋亡,通过流式细胞术。与空白组相比,pEGFP-NC组和shRNA-NC组细胞凋亡无差异。pEGFP-MT1JP组脑胶质瘤细胞凋亡率明显高于pEGFP-NC组,pGPU6-MT1JP-shRNA组细胞凋亡率低于shRNA-NC组。这些结果提示lncRNAMT1JP的过表达可促进胶质瘤细胞的凋亡,并且胶质瘤细胞中MT1JP基因的敲除可明显抑制胶质瘤细胞的凋亡。通过Transwell测定法检测每组中神经胶质瘤细胞的侵袭性,通过六个不同视野的细胞数。所述质粒pEGFP-NC和shRNA的-NC组。与pEGFP-NC组相比,pEGFP-MT1JP组的侵袭细胞数明显降低,而pGPU6-MT1JP-shRNA组的侵袭细胞数与shRNA-NC相比更高。这些结果表明lncRNAMT1JP的过表达可以抑制胶质瘤细胞的侵袭,并且胶质瘤细胞中MT1JP基因的敲除可以明显促进胶质瘤细胞的侵袭。实施Transwell迁移测定以确定神经胶质瘤细胞的迁移能力。pEGFP-NC组和shRNA-NC组的迁移细胞数没有差异。pEGFP-MT1JP组的迁移细胞数低于pEGFP-NC组,pGPU6-MT1JP-shRNA组的迁移细胞数明显高于shRNA-NC组。lncRNAMT1JP的过表达可以抑制胶质瘤细胞的迁移,并且胶质瘤细胞中MT1JP基因的敲除可以促进胶质瘤细胞的迁移。
为了探索lncRNAMT1JP对体内实验的影响,研究人员进一步在裸鼠中进行肿瘤异种移植。每隔5天,研究人员测量裸鼠中肿瘤发生的体积,在前20天,每组裸鼠的肿瘤体积没有显着变化,但是从注射细胞后20天开始,肿瘤的每个成分的体积变得越来越大,直到第40天,当裸鼠被治疗时。在第40天,研究人员用吸入二氧化碳杀死裸鼠,从裸鼠中轻轻取出肿瘤形成组织,将其置于电子形式,并记录每组裸鼠中每个肿瘤形成组织的重量。lncRNAMT1JP可抑制体内裸鼠的肿瘤发生,敲除lncRNAMT1JP基因可促进裸鼠体内肿瘤的发生。
胶质瘤被认为是中枢神经系统中的侵袭性恶性肿瘤,其特征在于高发病率和死亡率。胶质瘤的治疗取得了进展,例如手术,放疗和化疗,但大多数胶质瘤患者的总生存率仍然很低。lncRNAs在胶质瘤进展中发挥作用。关注lncRNAMT1JP在胶质瘤发展中的功能。总之,lncRNAMT1JP负责抑制增殖,侵袭和迁移,同时通过激活PTEN信号通路促进胶质瘤细胞的凋亡。MT1JP表达在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中下调。转染MT1JP过表达质粒后,胶质瘤细胞增殖,迁移和侵袭能力下降,胶质瘤细胞凋亡率增加,裸鼠致瘤能力下降。与正常肿瘤相比,lncRNAMT1JP在所有肿瘤样本中表达较低,如活,结肠,肺癌和胃癌。MT1JP的表达与WHO分级和胶质瘤的存活时间显着相关。已发现TUG1表达的下调与胶质瘤的分级,肿瘤大小以及KPS评分密切相关,提示TUG1在胶质瘤肿瘤发生中的重要作用。Kaplan-Meier分析结果显示,MT1JP低表达患者的总生存时间明显短于MT1JP高表达患者,多变量分析结果表明MT1JP低表达被认为是其独立危险因素。预测胶质瘤的总体存活率。已经发现lncRNAMT1JP的低表达与胃癌患者的总体存活率差有关。MT1JP的高表达在胃癌中存活率较低,显示MT1JP在胃癌中具有良好的预后作用。MT1JP是一种肿瘤抑制因子,通过负调节视网膜母细胞瘤进展中β-catenin信号通路的活性,可能作为视网膜母细胞瘤的预后生物标志物和治疗靶点。
研究发现MT1JP在胶质瘤中的功能主要基于PTEN信号通路。PTEN有助于拮抗磷酸肌醇3-激酶,然后削弱蛋白激酶B活化以抑制下游产物,从而通过上调ki-67表达和下调细胞周期蛋白D1表达来诱导细胞周期进展。同时,PTEN还可降低Akt磷酸化,抑制基质金属蛋白酶分泌,进一步抑制肿瘤侵袭和迁移。人类恶性神经胶质瘤,如星形细胞瘤和胶质母细胞瘤,显示出高水平的PTEN缺失和突变,导致PI3K通路的异常激活,尤其是Akt磷酸化的上调和诱导的活性。肿瘤细胞生长,增殖,侵袭以及转移。miR-130b通过调节PTEN信号通路在神经胶质瘤的发生和发展中起作用。所有这些都表明PTEN信号通路在胶质瘤的进展中起着至关重要的作用。
研究中与MT1JP表达相比的发现在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中下调。MT1JP的表达与神经胶质瘤的进展和预后密切相关。lncRNAMT1JP的过表达能够通过激活PTEN信号通路抑制增殖,侵袭和迁移以及诱导神经胶质瘤细胞的凋亡。这项研究可能有助于提高研究人员对胶质瘤发病机制和治疗方法的理解。lncRNAMT1JP在胶质瘤中的特异性机制需要进一步确认,以丰富研究人员对胶质瘤治疗的理解。
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