BDNF信号促进恶性胶质瘤细胞凋亡 |
恶性神经胶质瘤是最常见的侵袭性癌症,起源于中枢神经系统的神经胶质细胞。尽管胶质瘤大量的研究,有没有药治癌症,并已取得只有一些有限的治疗,以控制其进展。胶质瘤患者的中期存活时间为7至14.6个月,包括手术,放疗和化疗。脑源性神经营养因子是神经营养因子家族的成员,它被认为在各种类型的癌症,包括神经母细胞瘤,乳腺癌,肿瘤细胞的增殖,凋亡,侵袭和转移中发挥重要作用,和骨髓瘤。BDNF能抑制C6胶质瘤细胞凋亡率,提高细胞的生长和迁移。CREB参与细胞系统的增殖,分化和存活。CREB的激活可导致CREB诱导的转录和BDNF的表达。原肌球蛋白相关激酶B是BDNF的下游受体。它会触发许多信号级联,这对细胞生理活动至关重要。BDNF能激活TrkB的通过三个主要的下游信号,包括PI3K信号。
磷脂酰肌醇激酶可使肌醇环3-OH基团磷酸化,并将相关的信号蛋白募集到膜上,包括PDK1和Akt。13PI3K信号介导几种靶标的激活和抑制,导致细胞凋亡和增殖。糖原合成酶激酶是Akt的下游,在各种肿瘤中促进肿瘤生长和化疗耐药,包括胶质瘤和结肠癌。GSK-3B磷酸化的失活抑制癌细胞的凋亡。提示BDNF信号可能在胶质瘤生长和细胞凋亡的调节中发挥重要作用。AG1601是AG系列抗胶质瘤药物之一,并在原有基础上进行了改进。AG1601的相对分子质量远小于其他AG系列药物,例如AG1031。如先前的研究报道,AG1031和AG1503对C6胶质瘤细胞的凋亡有积极作用。AG1031已被FDA批准并表明承诺为神经胶质瘤的潜在治疗。AG系列抗癌药物显示出癌症的潜在治疗效果。AG1601是最新的AG系列抗癌药物,可能非常有希望用于治疗胶质瘤。研究AG1601是否能够抑制生长并诱导C6胶质瘤细胞凋亡及其潜在机制。
通过固定在立体定位支架上的10uL显微注射器向右侧纹状体注射大鼠C6神经胶质瘤细胞。用戊巴比妥腹膜内麻醉,将大鼠放置在立体定位仪。去除头骨上的毛发后,中间的一个小切口由头皮轻轻地制成。植入坐标由如下确定:直至中线3-3.5mm,前囟后0.5mm和硬脑膜下5mm深度。在坐标处钻一个1毫米的小孔。大鼠C6胶质瘤细胞以1uL每分钟的速度注射到纹状体中。注射后,将针停留约10分钟以避免回流。轻轻取出针头,用骨蜡密封孔,缝合切口。在外科手术后,将大鼠置于笼中并自由获取食物和水直至从麻醉中恢复。假手术组大鼠脑内注射等量DMEM。手术后将大鼠分为4个治疗组:羞耻组;羞耻+AG1601组;胶质瘤组;羞耻+AG1601组。每天一次静脉内注射神经胶质瘤大鼠,持续7天。
使用RIAP裂解缓冲液提取C6细胞和组织的蛋白质。用PBS洗涤细胞两次。用RIPA缓冲液在冰上裂解细胞和组织0.5小时。通过在12000rmp离心15分钟获得总蛋白质。收集上清液用于定量,通过BCA蛋白质测定试剂盒检测蛋白质的浓度。将等量的蛋白质负载量通过10%SDS-PAGE凝胶在恒定的120V下电泳约90分钟。将凝胶在100V下在冰水中转移90分钟到聚偏二氟乙烯膜上。将5%脱脂奶粉在含有5%吐温20的Tris缓冲盐水中封闭膜1小时,并在一抗中孵育如抗体和试剂部分所述,在4℃过夜,然后洗涤一段时间。将膜与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体以1:2000的浓度稀释1小时,然后用TBST再洗涤一段时间。通过计算机化学发光成像系统对蛋白质条带成像。B-肌动蛋白用作内部对照。通过NHIImageJ软件确定条带的量化。通过NHIImageJ软件确定条带的量化。
注射AG1601一周后,给所有动物注入0.1MPBS并用4%多聚甲醛固定。分离脑并用15%和30%蔗糖溶液以梯度脱水。脱水后,将大脑置于-20℃的OCT化合物中,切成10um。用苏木精和曙红染色脑切片。因此,可以在细胞水平观察肿瘤的形态。为了检测肿瘤的生长,进行Ki67的免疫荧光。用PBS溶解的0.1%TritonX-100使切片透化,然后在PBS中洗涤3×10分钟。将切片在PBS中的5%NGS中封闭1小时,并在4℃下在封闭溶液中稀释的抗Ki67中孵育过夜。在PBS中洗涤3×10分钟后,将切片在用PBS以1:1000稀释的AlexaFluor488-缀合的抗兔第二抗体中孵育1小时。所有荧光切片均由具有40x油物镜的LeicaTCSSP5激光扫描共聚焦显微镜成像。使用ImageJ分析图像的荧光。对于神经胶质瘤的细胞凋亡检测,进行TUNEL分析。将固定和透化的切片与TUNEL混合物在室温下孵育1小时。用PBS洗涤三次后,将切片用DAPI染色。凋亡细胞通过LeicaTCSSP5激光扫描共聚焦显微镜在40nm油物镜上在440nm处成像。
在C6细胞粘附于六孔板中的盖玻片后,用PBS洗涤细胞三次,并根据制造商的说明与20ug每毫升碘化丙啶)一起温育30分钟。温育后,用PBS洗涤细胞三次,用4%多聚甲醛固定10分钟,然后用三次PBS洗涤。取出盖玻片并将其连接到具有KPL荧光固定介质的载玻片上。使用Olympus荧光显微镜测定凋亡细胞。亮红色核被认为是细胞凋亡核。
AG1601是否影响C6细胞的增殖。用不同浓度的AG1601处理细胞12,24和48小时。MTT分析,当浓度和时间增加时,C6细胞的增殖减少。细胞增殖在100,200和400uM的浓度下显着降低。AG1601抑制了C6细胞的增殖,具有时间和浓度依赖性。提示BDNF信号在调节多种肿瘤的增殖和凋亡中起重要作用。AG1601处理后,进行了检查BDNF的信号有关的蛋白。研究人员发现BDNF作为BDNF信号的激活剂,可以逆转AG1601对C6细胞的抗增殖作用。PI染色还显示BNDF可降低AG1601诱导的C6细胞凋亡率,而K252a可增加AG1601引起的C6细胞凋亡率,这也表明AG1601与K252a联合可能被认为是治疗胶质瘤的潜在策略。AG1601还显着降低Bcl-xL的表达,并提高Bax的表达水平。BDNF激活AG1601诱导的BDNF信号的抑制以抵抗细胞凋亡。K252a增加AG1601引起的C6细胞凋亡。这些都表明BDNF信号在调节AG1601对C6细胞的抗增殖和促凋亡作用中起重要作用。为了验证研究人员的体外研究结果并检测AG1601对胶质瘤治疗的疗效,在Sprague-Dawley大鼠中建立了颅内C6胶质瘤的动物模型,并用AG1601给药。在第二周静脉内施用AG1601后,将神经胶质瘤大鼠的脑肿瘤剥离,拍照,测量并立即称重。胶质瘤大鼠的物理发现如下:在胶质瘤生长期间,一些动物在胶质瘤生长阶段表现出异常的身体症状,并且症状包括显着的体重减轻,鼻子出血,眼睛和嘴巴,驼背姿势和失去行动能力。与神经胶质瘤组相比,AG1601抑制肿瘤,显然减小尺寸和重量的肿瘤,而在整个治疗过程中存在着没有毒性的迹象假期和假手术+AG1601组体重稳定增长所描述的时期。显示胶质瘤+AG1601组的胶质瘤细胞密度与胶质瘤组相比明显降低。使用免疫荧光法检测两组胶质瘤和胶质瘤+AG1601胶质瘤组织中Ki67的蛋白水平。AG1601可显着降低Ki67的表达,抑制胶质瘤的生长。通过TUNEL测定检查了神经胶质瘤组织的细胞凋亡。结果显示胶质瘤组神经胶质瘤细胞凋亡难以检出。神经胶质瘤组织中细胞凋亡显着给药后用AG1601。提出AG1601促进了胶质瘤的凋亡。
研究人员检测了用AG1601处理的神经胶质瘤中Bcl-xL和Bax的表达水平。胶质瘤中Bcl-xL的表达远远高于正常组,并且在AG1601处理后其在胶质瘤中显着降低。Bax在胶质瘤组织中的表达低于正常组织,并且在给予AG1601的胶质瘤中显着增加),这表明AG1601对体内C6胶质瘤细胞凋亡具有积极作用。还在胶质瘤组织中检测了BDNF信号相关蛋白的表达。与假手术组的正常组织相比,BDNF信号的蛋白质表达在胶质瘤组织中上调。胶质瘤大鼠用AG1601处理后,胶质瘤+AG1601组肿瘤组织中BDNF信号相关蛋白的表达水平低于胶质瘤组。体内实验也表明AG1601可通过抑制BDNF信号抑制胶质瘤的生长和促进细胞凋亡。发现AG1601具有抑制大鼠C6胶质瘤细胞增殖和促进细胞凋亡的潜力,其潜在机制可能与BDNF信号有关。海外医疗网的研究人员还成功建立了C6胶质瘤大鼠并评估了AG1601的抗癌活性。发现AG1601通过BDNF信号通路抑制C6胶质瘤生长,提示AG1601是治疗恶性胶质瘤的潜在药物。
AG系列药物,包括AG1031和AG1503,有效地抑制了C6胶质瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。AG1601已在其他AG系列药物的基础上进行了优化。AG1601对C6胶质瘤细胞的抗增殖和促凋亡也有很好的效果。AG1601在体外抑制C6胶质瘤细胞的增殖,具有剂量和时间依赖性。BDNF信号对神经元中生长,发育和再生的调节具有很大影响。BDNF的信号也能调节细胞增殖,凋亡,侵袭和多种癌症细胞,包括乳腺癌,迁移多发性骨髓瘤和膀胱肿瘤。AG1601能抑制BDNF信号转相关蛋白。根据BDNF信号的作用,研究人员将这一信号作为AG1601抗癌作用于胶质瘤的潜在机制。重组成熟BDNF蛋白,作为BDNF信号的激活剂,可以促进胶质瘤细胞的增殖。BDNF反转上C6细胞的增殖。BDNF还能抵抗AG1601诱导的C6细胞凋亡。TrkB的特异性抑制剂K252a和AG1601共同加重了C6细胞的凋亡,这表明两种化合物的组合也可以被认为是胶质瘤的潜在治疗方法。
此外,还建立了胶质瘤模型,因为颅内脑肿瘤在神经肿瘤学研究中是必不可少的。恶性胶质瘤患者对包括化疗,放疗和手术在内的多种治疗方法的治疗效果仍然不佳,预后较差。AG1601显着减少的重量和肿瘤。用AG1601处理后,肿瘤中C6细胞的强度显着降低。肿瘤Ki67的免疫荧光表明AG1601也显着抑制C6胶质瘤的生长。的TUNEL分析还表明,AG1601增加C6胶质瘤的细胞凋亡。这些结果表明AG1601对胶质瘤具有良好的抗肿瘤活性。体内实验显示AG1601还抑制胶质瘤中BDNF信号的相关蛋白表达,GSK-3B信号通路可促进多种凋亡条件,GSK-3B促进细胞凋亡。GSK-3B是由通过PI3K信号转和GSK-3B的失活可促进血管生成和抑制细胞凋亡的磷酸化失活。AG1601抑制了失活的GSK-3B,后者促进细胞凋亡并抑制肿瘤的生长。AG1601增加了胶质瘤的细胞凋亡。这些证据均表明BDNF信号参与调节AG1601对C6胶质瘤细胞的抗增殖和促凋亡作用,研究人员发现AG1601可抑制BDNF信号通路,抑制恶性胶质瘤的生长,促进其凋亡。因此,AG1601可被视为治疗恶性胶质瘤的潜在药物。
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