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二糖醇抑制肝癌的增殖和迁移 |
预计原发性肝癌在全世界恶性肿瘤的发病率和死亡率中分别排名第六和第二。作为肝实质细胞肿瘤的肝细胞癌在组织学中约占80%。由于早期诊断的困难,很多肝癌患者通常被诊断为晚期并总是伴有复杂的并发症,特别是在中国。晚期肝癌的治疗特点是恶性程度高,转移和进展快,化疗药物的选择性和毒性低,导致治疗效果困难,患者生活质量差。因此,更有效的肝癌治疗方法值得进一步研究。与某些化学药物相比,天然产物及其衍生物具有更好的功效,更低的毒性,并且不太可能产生多药耐药性。它们中的大多数含有大量具有生物活性的抗癌化合物,并为对抗多种癌症提供了潜在的替代药物治疗方法。因此,从天然产物中提取有效的天然成分来治疗癌症值得进一步研究。二醇是从大叶黄杨中分离出来的化合物,大叶黄杨在一些亚洲国家被广泛用作草药。从大叶黄杨提取的化合物可用于治疗糖尿病,乳腺癌,肝癌。Dulcitol具有多种有益特性,包括抗癌,抗炎活性。研究表明杜西醇对小鼠胶原蛋白诱发的关节炎具有抑制作用。此外,Dulcitol可通过调节自噬途径显着抑制C6胶质瘤细胞的增殖。然而,尚未充分研究Dulcitol对HepG2细胞增殖,凋亡和转移的影响,并且尚不清楚潜在的分子机制。
转移扩散造成了90%以上的癌症相关死亡。肿瘤细胞侵袭和转移的进展是肿瘤治疗中的重大挑战之一。Sirtuins作为III类组蛋白脱乙酰基酶,在其反应中依赖NAD+作为共底物。最显着的成员SIRT1在包括细胞分化,衰老,凋亡,能量代谢和炎症在内的各种生物系统中起着至关重要的作用。多项研究报告称,SIRT1在许多肿瘤中高度表达,SIRT1蛋白水平升高与肿瘤分期有关。它通过使组蛋白和非组蛋白脱乙酰化来促进肿瘤细胞的增殖,阻断细胞凋亡,并最终导致肿瘤的发生,侵袭和转移。此外,上皮间质转化也是肿瘤侵袭的关键步骤。SIRT1在几种类型的肿瘤中诱导上皮间质转化,基因的沉默通过调节EMT进程降低了前列腺癌转移的动力,侵袭性和迁移能力。细胞外基质和基底膜等环境屏障的降解是入侵和诱导恶性肿瘤转移的关键。基质金属蛋白酶在降解ECM,血管生成,抗凋亡,肿瘤侵袭和迁移中起重要作用,并在肝细胞癌中高表达。一旦细胞外基质被破坏,可使肿瘤细胞容易地移入邻近组织,并导致肿瘤转移。在出国看病网研究中,提出了一种假说,Dulcitol通过调节MMP,SIRT1/p53信号通路有效抑制肝癌的增殖,迁移和侵袭。为了证实上述假设,在体内和体外研究了Dulcitol抗肿瘤的有效性。
人肝癌HepG2细胞获自中国科学院细胞库,该细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基中生长,培养基中添加了10%胎牛血清和50单位每毫升的青霉素-链霉素在5%CO2气氛中于37℃。将HepG2细胞与新鲜底物一起培养,该底物含有溶于蒸馏水或EX527或SRT1720的不同浓度的二甘醇溶解于2–8储存的DMSO中直到使用。根据先前的研究使用EX527和SRT1720的剂量。对照组与不含杜尔西醇的10%FBS孵育。通过MTT分析检查了Dulcitol对HepG2细胞增殖的影响。每孔将5×103个细胞接种到96孔板中,并分别与0、25、50、100、200、500uM聚二糖醇孵育24、48和72h。然后,将细胞与100ulMTT溶液再孵育4小时。加入200ulDMSO以溶解甲maz沉淀,并混合溶液以溶解反应的染料。在ELISA读数器上在492nm处检测每个孔的吸光度。Hoechst染色被用作与细胞凋亡相关的核形态变化。PI染色用于药物干预后检测细胞坏死。将HepG2细胞接种在6孔板中过夜,然后在细胞附着后48小时将Dulcitol添加到培养基中。将细胞用PBS洗涤3次后,用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。之后,将细胞与500ulHoechst33258染色溶液在黑暗中孵育30分钟。接下来,细胞在黑暗中用PI溶液染色10分钟。最后,在荧光显微镜下拍摄图像。
通过集落形成测定法检测了杜西醇对HepG2细胞增殖的影响。每孔将300–500个细胞接种到6孔板中过夜,以进行附着。第二天,在培养基中加入Dulcitol。每5天更换一次培养基。培养2周后,用PBS洗涤后,将菌落用4%多聚甲醛固定,然后用结晶紫染剂染色。然后,将板用ddH2O洗涤几次,干燥并照相。最后,将菌落溶于200ul冰醋酸中,并通过ELISA读数器在578nm处记录吸光度。通过伤口愈合测定法检测粘附的生长肿瘤细胞的迁移能力。1×106细胞将HepG2细胞接种到每孔6孔板中,并在无血清培养基中培养过夜。第二天,当细胞达到100%汇合时,用10ul移液管吸头刮擦单层,每根吸管尖端的两条无细胞直线在各孔中间宽度相同。用PBS洗涤后,除去非贴壁细胞。为细胞提供了不同浓度的杜西醇。在荧光显微镜下于0小时和24小时捕获原始划痕区域,划痕间隙的面积和宽度。对照和处理孔的划痕宽度通过ImageJ测量,并根据其各自在0h的值进行归一化。将HepG2细胞接种在6孔板中24小时,并与不同浓度的Dulcitol孵育。温育后,将细胞用PBS洗涤3次后用4%多聚甲醛固定。固定的细胞用10%NGS封闭1小时,然后与0.5%TritonX-100/PBS孵育10分钟。接下来,将细胞与抗Ki-67抗体,抗裂解的caspase3抗体在4过夜。在第二天,将细胞与山羊抗兔IgG在黑暗中孵育1小时。之后,用DAPI溶液将细胞核染色5分钟。最后,用荧光显微镜捕获图像。
在Dulcitol处理下,细胞的侵袭和迁移能力是通过在24孔板中使用带有8um孔过滤器的Transwell室进行测量的。用于侵袭测定的腔室涂有Matrigel。将200ul无血清培养基中的细胞接种到装有Dulcitol,SRT1720或EX527的培养基的上部Transwell腔室中,并在下部腔室中填充500ulDMEM以诱导趋化性。温育24小时后,将细胞用甲醇固定并用结晶紫染色。最后,对迁移和侵袭的细胞进行计数,并在荧光显微镜下以100×放大倍数捕获图像。每个实验进行三次。蛋白质印迹法用于研究SIRT1/p53信号通路中的几种关键细胞因子以及调节细胞迁移的蛋白质。将细胞与最终浓度的Dulcitol,SRT1720和EX527孵育48小时。将细胞用PBS洗涤,并于4时重悬于含有PMSF的RIPA裂解缓冲液中°C15分钟。通过在4℃离心收集上清液作为总细胞蛋白。以BCA蛋白质分析试剂盒测定,在12,000rpm的温度下于℃和12,000rpm下测定。最后,将每个样品40ug蛋白通过8%-13%SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上,然后用5%脱脂牛奶封闭1h,并轻轻摇动,然后与一级4抗体过夜。随后,将膜与第二抗体),HRP偶联物一起孵育,然后用TBST洗涤几次。蛋白信号强度为用成像系统进行检测,最后,使用ImageJ软件测定条带的密度,并以B-肌动蛋白的强度为标准。
由生物科学公司提供了20只6-8周大,体重20±2g的雄性无胸腺小白鼠。实验前至少7天使裸鼠适应。在每只小鼠的右腋下皮下注射1×107HepG2细胞0.2ml,建立异种移植模型。使用游标卡尺测量肿瘤体积,将小鼠随机分为对照组和治疗组。每天对所有小鼠进行8天的管饲。根据实验前经验选择治疗组中使用的杜西醇浓度。在最后一天,所有小鼠在称重后在氨基甲酸乙酯麻醉下通过颈脱位处死。然后分离所有肿瘤,照相并称重。
收集病理组织并在4%多聚甲醛中固定过夜。将组织用0.01MPBS洗涤1h,然后用梯度乙醇脱水,用二甲基苯玻璃化,然后包埋在石蜡中,切成6um的切片。之后,分别用二甲苯,95%乙醇,90%乙醇和80%乙醇和ddH2O对玻片进行脱蜡。将载玻片与0.01M柠檬酸钠缓冲溶液蒸煮3分钟,共孵育3次,然后与0.5%TritonX-100/PBS孵育10min,然后浸入3%过氧化氢中10min。将载玻片用10%NGS封闭1小时。随后,将载玻片与一抗在4℃孵育过夜。℃。接下来,通过与DAB溶液一起温育观察载玻片,并用苏木精弱染色。最后,将染色的切片在荧光显微镜下可视化。此外,将肿瘤切片用苏木精-曙红染色以进行组织学检查。总体数据通过SPSS软件以一式三份的平均值±SEM表示。使用ANOVA,然后进行LSD多重比较测试,对多个组进行比较。两组之间的比较使用t'检验进行。原始数据是使用Kruskal–Wallis检验执行的。p<0.05被认为具有统计学意义。
MTT分析显示,使用不同剂量的Dulcitol处理后,HepG2细胞的抑制率逐渐增加,并且随着处理时间和浓度的增加而增加,提示剂量为-时效关系。对照组与25uM的Dulcitol治疗组或50uM的组之间的细胞活力在统计学上均无差异。与对照组相比,在100uM的二十二烷醇下72h细胞抑制率有统计学差异。此外,与对照组相比,在200uM的Dulcitol作用下24、48和72h,细胞抑制率也有显着差异。接下来的研究中,在48小时内的浓度为50–200uM。发现在HepG2细胞中,在施用杜尔西醇的过程中存在不同形式的膜破裂,核浓缩和起泡。最明显的单层细胞死亡和脱落在HepG2细胞中发生,用200uM的杜克糖醇干预48小时后。用Hoechst33258/PI双重染色在荧光显微镜下观察了Dulcitol处理后HepG2细胞的凋亡和坏死。正常HepG2细胞的细胞核呈均匀蓝色,轮廓清晰,呈椭圆形。凋亡细胞的特征是核的浓缩和染色质高,聚集在核膜上,甚至变得固结或破碎。用PI染色将坏死细胞染色。随着Dulcitol剂量的增加,凋亡细胞和坏死细胞的数量逐渐增加。较高浓度的二甘醇明显增加了坏死细胞的数量。这些结果表明,Dulcitol抑制了HepG2细胞的生长,并以剂量依赖的方式促进了细胞凋亡。
为了阐明Dulcitol在HepG2细胞中调控的相关信号传导途径,通过免疫荧光和Westernblot检测了SIRT1/p53信号传导途径中涉及的蛋白质。二醇在HepG2细胞中以剂量依赖性方式降低SIRT1的蛋白表达并增加p53蛋白。同时,Dulcitol上调了Bax的蛋白表达,Caspase3裂解,Caspase9裂解,而Bcl-2蛋白下调。此外,细胞溶质中细胞色素c的量显着增加,这表明细胞色素c从线粒体释放到细胞质中。数据表明,Dulcitol通过SIRT1/p53途径触发了细胞凋亡,并激活了HepG2细胞中的半胱天冬酶级联反应。已通过免疫荧光测定法检查了在凋亡信号通路中起重要作用的裂解半胱天冬酶3的表达。随着半乳糖苷浓度的增加,裂解的半胱天冬酶3的表达水平明显提高,这表明与半乳糖苷酶处理可以显着促进HepG2的凋亡,这与形态学观察一致。在这方面,为了评估SIRT1是否参与了Dulcitol对细胞增殖的抑制作用,将HepG2细胞与Dulcitol和SIRT1抑制剂一起培养。出国看病网发现EX527降低了SIRT1,Bcl-2的蛋白质表达,并增强了p53,乙酰化p53,Bax,半胱天冬酶3,半胱天冬酶9和细胞色素c。此外,Hoechst33258/PI双重染色法还显示EX527可以像Dulcitol一样促进HepG2细胞的凋亡和坏死。Dulcitol与EX527结合能够更有效地促进HCC细胞凋亡。此外,与Dul组相比,SRT1720组中p53,Caspase3,Caspase9和Cyto-C蛋白的表达明显降低。除了SIRT1的水平显着增加外。结果发现,Dulcitol对调节p53,乙酰化p53的水平和Bax/Bcl-2的比例以及诱导caspase3,caspase9和Cyto-C的裂解的作用被消除了。SRT1720治疗。提示SIRT1可能在抑制HCC增殖中起关键作用,而Dulcitol则通过SIRT1/p53信号通路发挥其抗肿瘤作用。
伤口愈合试验用于探讨杜西醇是否可以抑制HepG2细胞的迁移。数据显示,Dulcitol以浓度依赖的方式抑制了HepG2细胞的迁移能力。将HepG2细胞与200uM的杜克糖醇孵育24小时后,与对照组相比,迁移距离显着减少了21%。数据表明,Dulcitol是HepG2细胞迁移的抑制剂,而200uMDulcitol的组对伤口愈合具有显着的预防作用。此外,杜糖醇可以抑制HepG2细胞的集落形成能力,这对肿瘤的增殖过程具有重要意义。菌落形成试验表明,随着菌落形成数量的减少,生长速度减慢,而Dulcitol干预浓度增加时,增殖能力减弱。所有结果表明,随着化合物浓度的增加,Dulcitol抑制HepG2细胞增殖的能力增强,这与细胞凋亡实验的结果一致。此外,根据伤口愈合试验,HepG2细胞的迁移能力被显着中断,并且在用EX527处理后,通过菌落形成试验,HepG2细胞的增殖能力被显着抑制。在Dulcitol组和EX527组之间具有可比的治疗效果。更有趣的是,发现与Dulcitol组或EX527组相比,联合组可产生更好的结果。此外,通过SRT1720处理,HepG2细胞的增殖和迁移能力显着增强,而杜克醇诱导的抗增殖被有效消除。根据Transwell室分析,Dulcitol以浓度依赖性方式显着抑制HCC细胞的迁移和侵袭能力。同时,EX527对HepG2细胞的转移和侵袭具有抑制作用。组合组的指标明显减少,SRT1720促进了HepG2细胞的转移和侵袭,并逆转了Dulcitol诱导的抗转移。这表明Dulcitol是HepG2细胞迁移和侵袭的抑制剂。肿瘤细胞的增殖活性是肿瘤恶性的重要指标。为了评估细胞增殖活性,可以使用免疫荧光检查周期特异性抗原,例如Ki-67。发现Dulcitol抑制了Ki-67蛋白的表达,表明Dulcitol的抗癌活性与肿瘤细胞增殖的抑制有关。
为了研究在Dulcitol处理下HepG2侵袭和迁移的潜在分子机制,采用WesternBlot方法检测了MMP-2,MMP-9,E-cadherin和uPA的蛋白表达。数据显示,在用度西洛尔治疗后,E-钙黏着蛋白的表达明显增加,而MMP-2,MMP-9,uPA则呈剂量依赖性降低。Dulcitol和EX527在中断HepG2细胞的迁移能力方面也有类似作用。与Dulcitol组或EX527组相比,Dul&EX527组中MMP-2,MMP-9,uPA的相对蛋白水平降低和E-钙粘蛋白上调的幅度更大。Dul组相比,SRT1720组E-cadherin蛋白表达显着降低,MMP-2,MMP-9和uPA蛋白表达显着增加。此外,Dul+SRT1720组的E-钙粘蛋白水平低于Dul组,而uPA的蛋白水平则高于Dul+SRT1720组。在Dul组中。成功建立了HepG2异种移植瘤模型,探索了杜糖醇的体内抗肿瘤活性。数据显示,Dulcitol组的肿瘤生长率显着降低,与对照组相比,肿瘤的重量减少。两组之间的体重没有显着变化。Ki-67染色显示,Dulcitol处理可明显降低Ki-67的表达。肿瘤切片的组织学分析显示,对照组中具有明显核仁和大核的肿瘤细胞排列紧密,而Dulcitol治疗组则排列疏松。在Dulcitol处理后,裂解的半胱天冬酶3的表达上调而MMP-2下调。肿瘤组织的蛋白质印迹分析表明,杜西醇可通过减少SIRT1,Bcl-2的表达并增加p53,乙酰化p53,半胱天冬酶3,半胱天冬酶9,Bax,Bax/Bcl-2和细胞色素c。此外,杜西醇可通过抑制MMP-2,MMP-9,uPA的蛋白表达以及上调E-钙粘蛋白的表达来干扰肿瘤的侵袭和转移。结合所有这些数据得出结论,Dulcitol在肝癌的凋亡和转移中起着极其重要的作用。
癌症已成为社会上最致命的疾病之一,由于其高度恶性和转移性,癌症以持续不断的方式扩散并增加发病率。尽管癌症治疗取得了进步,但肝细胞癌仍然是全球癌症相关死亡的常见原因,其临床治疗通常受到限制。出国看病网的研究旨在阐明Dulcitol对HepG2细胞的抗肿瘤作用,并进一步探讨其下的分子机制。数据表明,Dulcitol以剂量和时间依赖性方式抑制HepG2细胞的增殖。Dulcitol充当SIRT1的抑制剂,并通过抑制SIRT1/p53信号通路诱导细胞凋亡。此外,Dulcitol抑制了HepG2细胞的迁移和侵袭,并显着下调了MMP2和MMP9的水平,并上调了与肿瘤侵袭有关的E-钙粘蛋白。凋亡可通过调节Bcl-2家族和caspase家族而由线粒体调节的内在途径触发。Bcl-2家族成员之间的平衡和蛋白质-蛋白质相互作用决定了细胞是否经历细胞存活或凋亡。因此Bax/Bcl-2比对细胞凋亡的发生和程度具有重要意义。促凋亡蛋白通过促进细胞色素c的线粒体释放来调节细胞凋亡,这在激活细胞质中线粒体依赖性死亡中起着关键作用,而抗凋亡蛋白则通过阻断这种释放来发挥作用。一旦细胞色素c被激活,细胞凋亡信号通路将被放大,并且细胞死亡被认为是不可逆的。半胱天冬酶9是固有凋亡途径的凋亡启动子蛋白酶。一旦被激活,下游执行子半胱天冬酶3被触发,然后裂解细胞底物,伴随细胞凋亡。对于大多数常用的抗癌药物而言,激活凋亡途径杀死癌细胞仍然是关键的抗癌机制。因此,研究卫矛醇是否能够诱导肝癌细胞的细胞凋亡在体外和体内。在研究中免疫荧光分析表明,随着Dulcitol剂量的增加,裂解的caspase3的表达也逐渐增加。Hoechest33258/PI染色提示凋亡和坏死细胞随给药浓度的增加而增加。发现200uM的杜克西醇显着增强了Bax蛋白的表达,并降低Bcl-2蛋白的表达,因此Bax/Bcl-2的比例明显增加。同时细胞色素c和半胱天冬酶3,半胱天冬酶9也增加,从而诱导细胞凋亡。以上结果证明,杜西醇可诱导HepG2凋亡,从而抑制HCC增殖而不影响小鼠的体重增加。
近年来,SIRT1基因在肿瘤发生和转移中的关键作用近年来引起了广泛的关注。SIRT1表达和活性的抑制通过使p53的Lys382残基脱乙酰化,抑制了癌症的增殖,侵袭和迁移,并促进了肿瘤细胞的凋亡。在选择这些细胞应激的情况下,p53缺陷的细胞易于逃避凋亡途径,并无限期增殖。此外,p53可以通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用促进Bax寡聚化,并与Bcl-2和Bxl-XL形成抑制性复合物,使线粒体膜透化并释放细胞色素c,并最终诱导细胞凋亡。在研究中发现Dulcitol通过以剂量依赖的方式下调SIRT1的表达来上调p53的乙酰化作用。随后p53的激活促进细胞色素c从线粒体释放到细胞质中,激活胱天蛋白酶级联反应,最终导致肝癌细胞凋亡。综合所有证据知道SIRT1可能是Dulcitol抑制HCC增殖的潜在靶标。为了验证该假设,使用了SIRT1抑制剂和激动剂。单独施用EX52748小时显示Dulcitol在增加Bax蛋白表达,Bax/Bcl-2比,裂解半胱天冬酶3,裂解半胱天冬酶9,细胞色素c和降低Bcl-2蛋白表达方面具有相似的作用。发现Dulcitol产生了EX527的近似作用,并且对EX527的作用增强了。但是,SRT1720具有逆转录作用,可诱导二甘醇诱导凋亡。数据表明,通过调节SIRT1/p53信号通路促进肿瘤细胞内在凋亡可能是Dulcitol的主要抗癌机制。综合所有证据结果暗示SIRT1可能是Dulcitol抑制HCC增殖的潜在靶标。
肿瘤转移包括细胞粘附,增殖,侵袭和运动,这仍然是一个复杂的多步骤过程。EMT在肿瘤转移中起着至关重要的作用,它参与多种生物标志物的修饰过程。Ca2+依赖性细胞粘附分子E是介导细胞与细胞和细胞与基质粘附的粘附附着的主要标志。此外,它在维持和建立细胞外基质的上皮完整性中起着至关重要的作用。E-钙黏着蛋白的减少将破坏细胞与细胞的粘附和连接,促进癌细胞的侵袭和转移。基质金属蛋白酶可以诱导E-钙粘蛋白裂解,是导致肿瘤迁移的原因。MMP-2和MMP-9都是MMPs家族的两个主要成员,它们在ECM和基底膜的降解中起着至关重要的作用,并为肿瘤的形成提供有利的微环境。MMPs蛋白在所有类型的癌症中几乎都增加,这与晚期肿瘤,侵袭和转移增加以及生存期缩短有关。同时研究表明,srokinase型纤溶酶原激活物催化酶原酶原酶裂解为纤溶酶,然后直接降解周围的ECM,导致细胞入侵和迁移。高水平的uPA与患者存活率降低有关。在研究中,Dulcitol以剂量依赖性方式显着抑制HepG2细胞的迁移和侵袭。Westernblot分析进一步揭示,在体内和体外,Dulcitol处理均下调MMP-2,MMP-9和uPA的表达,并上调了E-钙粘蛋白,表明降解ECM在Dulcitol对HepG2细胞的作用机制中起着重要作用。此外,单独给予EX527表现出类似的杜尔西醇的作用。桂皮醇与EX527结合产生协同作用,而SRT1720通过抑制细胞的侵袭和迁移而废除了桃皮醇的活性。结果表明SIRT1/p53信号通路的调控与转移因子密切相关。肝癌转移的二糖醇逆转可能与SIRT1的作用有关。Dulcitol可能充当SIRT1的天然活性抑制剂,并通过抑制肿瘤细胞的增殖和迁移来阻止HCC转移。另外,结果表明,Dulcitol可能通过调节SIRT1/p53途径在抗肝癌功能中发挥关键作用,并通过降解ECM抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。此外,Dulcitol将来可以进一步成为预防和帮助治疗肝癌的创新有效药物。
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