外来体在肺癌中的生物学功能及临床应用

　　肺癌仍然是世界范围内与癌症相关的死亡的主要原因，而且高发病率令人担忧。外泌体是大多数细胞分泌的一类细胞外囊泡，包括RNA，蛋白质和脂质。外泌体可以在生理和病理过程中介导细胞间的通讯。累积的证据表明，癌症来源的外泌体有助于募集和重编程与肿瘤微环境相关的成分。此外，已经在晚期肺癌患者中完成了基于外来体的临床试验。在这篇综述中，我们讨论了外泌体在肺癌微环境中的作用，例如其参与肺癌的发生，发展和转移，以及参与血管生成，上皮-间质转化，免疫逃逸和药物抗性。
　　 出国看病服务机构总结到，2018年预计有180万人死亡，占癌症死亡人数的近五分之一。肺癌分为包含腺癌和鳞状细胞癌的小细胞肺癌和非小细胞肺癌。重要的是，很大的进步已经在非小细胞肺癌，治疗制成，例如表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，间变性淋巴瘤激酶的抑制剂和贝伐单抗，以及免疫抑制剂的检查点。但是，只有一小部分患者从这些药物中受益。近年来，对外泌体的生物功能和生化性质进行了广泛的研究，可以为肺癌的发生和发展的分子机制提供新的认识，并有助于开发针对肺癌患者的新的诊断和治疗策略。
　　 外来体是一类细胞内吞起源的细胞外囊泡用的具有直径为30-100纳米，在1.13-1.19微克/毫升。一些人首先将绵羊网织红细胞成熟过程中释放的囊泡定义为外来体。
　　 外来体是膜结合磷脂囊泡，包括蛋白质，核酸和脂质。外来体由大多数细胞类型，特别是肿瘤细胞分泌；肿瘤来源的外来体在肿瘤细胞与其微环境之间的交流中起着重要作用，有助于为肿瘤的发展创造良好的土壤。值得注意的是，外来体已经被分离在大多数生物流体，如血清和血浆，唾液，尿液，乳汁，精液，羊水，脑脊液，胸腔积液，支气管灌洗液，腹水，滑液和胆汁。此外，外泌体为运输小RNA提供了保护性的小泡，可抵抗RNA酶的降解。这些特殊特征使外泌体成为液体活检的理想标本。另外，作为外来体的治疗潜力进行了探讨，基于外来体Ⅰ和Ⅱ期临床试验已经在晚期肺癌患者完成，具有良好的安全性。在另一方面，外来体近来已经成为关注的焦点作为药物递送载体可以递送化疗药物和生物制剂用于肺癌治疗。
　　 在这里，我们描述了外泌体如何形成并释放到细胞外空间，并讨论了用于外泌体分离和纯化的某些技术的优点和局限性。我们还总结了参与肺癌微环境重编程的外泌体的最新研究。最后，我们关注外泌体作为潜在生物标志物和药物传递载体的作用，以及在基于外泌体的免疫治疗中的作用。
　　 外来体的形成，释放和摄取
　　 胞外囊泡的膜囊泡的异质群体，基于他们的生物合成被分为三个不同的类：外来体，微泡和凋亡小体。当通过质膜的内向芽将膜蛋白内吞形成早期的内体时，外泌体开始形成，然后，早期的内体成熟为晚期的内体，也被称为多囊泡体，其中包含由内膜形成的大量腔内囊泡。内体膜的内陷。期间内陷，胞质和膜蛋白质，脂质，和RNA的掺入ILVS。MVBs可以与溶酶体融合，导致由囊泡进行货物的降解。或者，MVB可与质膜融合，将外泌体释放到细胞外空间。
　　 排序复杂所需的运输内体和相关蛋白参与泛素化蛋白分选和ILVS的形成。但是，货物的分类和ILV的形成不仅取决于ESCRT复合物，还需要鞘脂神经酰胺。此外，四次跨膜蛋白也参与外来体，如CD9的生物发生，CD63，CD81和CD82富集来自不同类型的细胞，其能够形成寡聚复合物，并用整联蛋白相互作用和MHC分子。小GTP酶的拉布家族，例如，Rab5的是所必需的早期内涵体，晚期内涵体和溶酶体的生物合成，RAB7调节货物从MVBs转移到溶酶体，RAB35，Rab27a和Rab27b参与MVBs融合细胞膜和分泌的外来体。但是，控制特定RNA种类向外泌体的分类的机制尚未显示。表明miRNA可以加载到外泌体中，并通过神经酰胺依赖性途径释放，但不能通过ESCRT机制释放。根据报道说，蛋白质异质核核糖核蛋白A2B1控制的miRNA通过与miRNA的特定基序结合而排列成外泌体。证明了外来体中miRNA的上载受亲本细胞中miRNA靶水平的细胞激活依赖性变化的调节。
　　 由于其内体来源，几乎所有外泌体都包含涉及MVB生物发生的蛋白，细胞内膜转运和融合和四跨膜蛋白，它们被用作表面标记。用于外泌体鉴定。外泌体包含参与抗原呈递的热激蛋白，并将肽包装成MHC分子。外泌体还含有可能将外泌体定位到受体细胞的整合素。此外，外泌体富含脂质筏，例如胆固醇，神经酰胺和鞘脂，它们在其亲代细胞的膜脂质分布中表现出差异。
　　 然后，外来体获取到受体细胞，之后，它们可以结合表面受体，并诱导胞内信号传导。外来体可以通过网格蛋白依赖的和网格蛋白胞吞作用独立地采取由受体细胞，如胞饮作用，吞噬作用和大胞饮。另外，囊泡和脂质筏介导的内吞作用也可以使外来体内在化。另一方面，外泌体可以直接与质膜融合，并将其内容物释放到细胞质中。
　　 外泌体的分离与纯化
　　 从细胞培养上清液和生物液体中分离和纯化外泌体对于生物医学研究和临床应用至关重要。通常，外泌体的分离方法主要基于外泌体的物理，化学和生物学特性。超速离心是用于外泌体分离的最广泛使用的常规方案，该方法包括一系列以增加的速度离心以去除死细胞和大的细胞凋亡碎片，然后进行最终的高速超速离心以沉淀外泌体。然而，该方法需要大量时间和昂贵的仪器，沉淀的外泌体可能含有聚集的蛋白质。由于外来体具有1.13-1.19的漂浮密度克/毫升在蔗糖梯度上，基于在细胞外囊泡不同的漂浮密度，采用蔗糖梯度离心有助于进一步分离不同密度囊泡因此，，该方法被认为以更高的纯度沉淀外泌体。最近，几种商业试剂盒，例如依靠聚合物共沉淀的ExoQuick已被广泛用于分离外泌体。通过ExoQuick沉淀的外泌体可以在低离心力下轻松快速地分离，而这种方法可能会共分离异质聚合物颗粒且缺乏特异性。外泌体表达丰富的膜蛋白，例如MHCI和II分子，共刺激分子和粘附分子，可用作外泌体免疫分离的标记。一些科学家利用磁珠，包被有HLADR，DQ和DP特异的单克隆抗体，用于从无细胞上清液中特殊分离外泌体，这是一种分离抗原呈递细胞外泌体的快速方案。特别是，超滤适用于从大量的条件培养基中纯化外泌体。结合超滤和超速离心纯化源自APC的临床级外泌体。另一方面，大小排阻纯化与外泌体的密度梯度分离相当。部分科研人员使用尺寸排阻色谱法从人血浆中分离细胞外囊泡，他们研究了SEC从无血小板浓缩液的人无血小板上清液中纯化了直径大于70nm的细胞外囊泡，此外，囊泡沉淀的HDL小于5％少于蛋白质的1％。此外，场流分离和微流控芯片还开发了以提高纯化效率。值得注意的是，胎牛血清也含有外泌体并影响培养的细胞表型，因此，在提取外泌体之前，经过18h超速离心，条件培养基被FBS去除了外泌体。从细胞培养上清液或其他生物液体中分离和纯化外泌体后，进一步分析囊泡的大小分布，形态和表面标记，以确认它们是外泌体，表1总结了外泌体的分离和检测技术。
　　 外泌体在肺癌微环境中的作用
　　 外泌体包含RNA，蛋白质和脂质，所有这些都会影响外泌体功能并反映细胞特征。外来体的主要的核酸是含有微小RNA，酰tRNA的RNA，和长链非编码RNA，并在很大程度上片段化的mRNA。外泌体将RNA转移到受体细胞，mRNA可能被翻译成蛋白质，miRNA可以调节宿主细胞中目标mRNA的翻译。此外，外泌体蛋白也可以转运到受体细胞并引发强烈的细胞反应。外来体可以通过将其内含物转移到肺癌微环境中的靶细胞中，从而调节肺癌细胞的进程，从而成为一种新型的细胞通讯方式。
　　 外来体在肺癌血管生成中的作用
　　 肿瘤的生长和转移需要新的血管来补充氧气和营养，从而激活血管生成和血管生成，从而使血管从邻近组织发芽到肿瘤中。发现肿瘤来源的miR-9通过微囊泡转移到内皮细胞中，并且miR-9有效降低了细胞因子信号传导抑制因子5的水平，并诱导了JAK-STAT通路的激活，最终促进了内皮细胞的迁移和肿瘤的发展。血管生成。携带激活的EGFR的A549细胞分泌的外泌体可以通过共培养的内皮细胞内在化，该内皮细胞激活MAPK和AKT信号传导，并诱导内皮细胞表达血管内皮生长因子，然后通过自分泌激活VEGF受体2，促进肿瘤血管生成。在缺氧条件下，肺癌细胞外泌体中miR-23a显着增加，外泌体将miR-23a转移到内皮细胞中。miR-23a直接抑制其靶脯氨酰羟化酶1和2的表达，导致缺氧诱导因子1α在内皮细胞中积累。因此，低氧性肺癌细胞衍生的外来体增加了内皮的通透性，癌细胞在体外的跨内皮迁移，增强了体内的新血管形成和肿瘤生长。发现吸烟导致血清miR-21水平升高，从香烟烟雾提取物转化的人支气管上皮细胞中分离出的外泌体也显示高水平的miR-21。转化的HBE细胞通过外来体将miR-21传递到正常的HBE细胞中，从而激活IL-6/STAT3信号传导并增强受体细胞中VEGF的表达，从而促进HBE细胞中的血管生成。筛选出外泌体lncRNA，lnc-基质金属蛋白酶2-2明显富含转化生长因子-β处理的A549细胞，并促进了MMP2表达。共培养实验表明，TGF-β介导的外来体作为细胞间通讯的载体，可调节血管通透性和肺癌的侵袭。由于肺癌细胞中金属蛋白酶-1组织抑制剂的过表达，miR-210在外泌体中表达上调。这些外泌体促进了人脐静脉内皮细胞中的管形成活性，这反映在源自A549L的肿瘤异种移植物中血管形成的增加。总之，这些结果支持外泌体作为一种新颖的促血管生成机制，可以通过在肿瘤细胞和内皮细胞之间定向转移血管生成因子来调节肿瘤微环境中的血管重构，从而促进肿瘤血管生成。
　　 外泌体与上皮间质转化
　　 上皮-间质转化是高度保守的过程，其通过细胞间粘附的丧失和间充质表型的获得证实，这有利于肿瘤细胞的迁移和侵袭性。有趣的是，最近的研究表明，外来体参与了EMT过程，在此期间，在受体细胞中[外来体转移的肿瘤细胞和微环境，和调节的信号转导之间的间充质相关联的信息。从TGF-β1诱导的间充质细胞分离的外泌体表明，β-catenin的表达增加，E-cadherin以及波形蛋白减少。同时，miR-23a在分泌的外泌体中显着上调。进一步的研究表明，外来体在经历EMT的A549细胞中刺激了TCF4/β-catenin转录活性并激活了经典的Wnt信号传导。他们发现来自高转移性肺癌PC14HM细胞的外泌体表达的波形蛋白高于非转移性肺癌PC14细胞。当用PC14HM外泌体处理人支气管上皮细胞时，波形蛋白表达显着上调，从而诱导受体HBEC中的EMT。这些结果表明，尽管需要进行更多的研究，但肿瘤来源的外来体是EMT的重要介体，从而将肿瘤细胞转化为更具攻击性的表型。
　　 外泌体调节肺癌的生长
　　 越来越多的证据表明，外来体在癌症中起着双峰作用，它们可以对局部和全身环境进行编程，以帮助癌症的生长和扩散。A549细胞衍生的外来体被间充质干细胞内化，该细胞显着刺激IL-6，IL-8和MCP-1的产生并募集巨噬细胞，从而促进肿瘤的生长。进一步检测到，来自A549细胞的外泌体表面上的Hsp70通过Toll样受体2激活了NF-κB信号传导，从而诱导了MSC的促炎表型。证实肥大细胞，例如HMC-1衍生的外泌体包含c-KITmRNA，HMC-1外泌体将KIT蛋白转移到A549细胞，随后激活KIT-SCF信号传导，从而增加细胞周期蛋白D1的表达并加速A549细胞的增殖。根据研究发现，从A549细胞分离的外泌体中miR-21和miR-29a明显上调。外泌体miR-21和miR-29a结合并激活周围免疫细胞中的Toll样受体，导致肿瘤生长和转移。血小板衍生的外泌体将糖蛋白IIb/IIIa传递到肺癌细胞表面，并诱导MAPKp42/44和AKT磷酸化，以及cyclinD2在肺癌细胞中的表达，从而促进了肺癌细胞的增殖。电动汽车将miR-142-3p从肺腺癌细胞转移到内皮细胞和成纤维细胞，通过抑制内皮细胞中的TGFβR1促进血管生成。此外，EV相关的miR-142-3p也促进了癌症相关的成纤维细胞转化，但并未靶向肺成纤维细胞中的TGFβR1。综上所述，这些数据表明外泌体可以将miRNA从肺癌细胞转移到其他非癌细胞，并通过与靶mRNA结合而调节宿主细胞中的基因表达，此外，外泌体蛋白还可以直接激活宿主细胞中的信号传导，从而调节肺癌的生长和增殖。
　　 外泌体与肺癌的免疫逃逸
　　 肿瘤来源的外泌体携带免疫抑制分子，并将这些物质转移至免疫细胞，直接或间接抑制免疫细胞的功能，从而促进肿瘤进展。据报道，来自人黑素瘤，乳腺癌和肺癌细胞的外泌体带有免疫抑制性PD-L1，PD-L1通过其胞外域与PD-1结合，从而使T细胞失活。干扰素-γ上调了PD-L1的表达，抑制了CD8T细胞的功能并促进了肿瘤的生长。此外，还揭示了外泌体PD-L1使肿瘤细胞延长生存期的机制，外泌体PD-L1的遗传阻滞可促进引流淋巴结中的T细胞活性，从而诱导全身性抗肿瘤免疫力和记忆力。报道低氧肿瘤源性微囊泡带有免疫抑制分子，可以在体外和体内抑制自然杀伤细胞的细胞毒性。发现从肺癌活检组织中分离出的外泌体中有80％以上包含EGFR，树突状细胞可以捕获这些外泌体以分化为耐受性DC，这可以将幼稚的CD4+T细胞转化为肿瘤抗原特异性调节性T细胞，从而抑制了肿瘤特异性CD8+T细胞的功能。总体而言，这些数据表明，肿瘤来源的外来体可以通过逃避可能代表治疗靶点的免疫细胞的监视来抢救肿瘤细胞，从而有助于开发用于癌症治疗的免疫治疗方法。
　　 外泌体与肺癌转移
　　 转移是肿瘤细胞浸润，在血管中存活，附着于宿主器官并在宿主器官中定殖的复杂的多步骤过程，在此过程中，外泌体在细胞间通讯中充当功能性介质，影响转移级联反应的各个步骤。一些科学家已经证明某些外泌体整合素正在“寻址”特定器官的癌细胞并预测器官特异性转移，其中外泌体整合素α6β4和α6β1与肺转移有关，而外泌体整合素αvβ5与肝转移有关。一些证据证实NSCLC患者的血小板表达的miR-223水平高于健康受试者的血小板。用血小板分泌的微泡孵育A549细胞可抑制A549细胞中红细胞膜蛋白带4.1样33'UTR的翻译，从而促进A549细胞的侵袭。与对照组相比，色素上皮衍生因子处理的A549细胞的外泌体显着抑制了细胞运动，并且进一步发现PEDF通过增加血小板反应蛋白1的表达降低了癌症衍生的外泌体介导的转移活性，并增加了其外泌体中的内含物。由于THBS1抑制了细胞骨架的重塑以及肺癌细胞的迁移和侵袭，因此在转移前的生态位中含有THBS1的外来体可以阻止肺癌的进展。与肺细胞相比，3T3-L1脂肪细胞中MMP3蛋白增加。3T3-L1脂肪细胞外泌体将MMP3转移至3LLLewis肺癌细胞，然后MMP3诱导3LL细胞中MMP9表达，并促进3LL细胞在体内外的侵袭。
　　 在NSCLC中，骨转移是常见的并发症。研究表明，来自NSCLC细胞的外泌体含有高水平的EGFR结合两性调节蛋白，可诱导破骨细胞中EGFR信号的激活，进而上调基质金属蛋白酶9和抗酒石酸的表达磷酸酶，与破骨细胞分化有关的著名基因，触发溶骨性骨转移。此外，其他人员证明了miR-21在A549细胞的外泌体中过表达，而外泌体miR-21被破骨细胞祖细胞吸收，抑制了受体细胞中PDCD4的表达，从而促进了破骨细胞的形成。
　　 SCLC非常适合早期脑转移，后者会导致大多数与SCLC相关的死亡。与源自人脑微血管内皮细胞的囊泡共培养的SCLC细胞显示，膜联蛋白家族蛋白的伴侣S100A16被显着上调。同时，HBMECs外泌体诱导受体SCLC细胞中的S100A16从细胞质向核移位，从而触发了线粒体内膜中的蛋白inhibitin-1的表达，以维持线粒体膜的电位，促进脑转移性SCLC细胞逃脱死亡信号并在大脑中生存。
　　 综上所述，这些发现表明，肿瘤来源的外来体在癌细胞与它们的局部和远距离微环境之间起着串扰作用，并且能够介导器官特异性转移，这为斯蒂芬·佩吉特的“种子和土壤”假说提供了支持。
　　 外泌体作为肺癌的诊断和预后生物标志物
　　 有比低剂量计算机断层扫描。重要的是，液体活检正在发展为肺癌的微创诊断和预测工具。发现补体片段C4d在肺癌患者的生物样品中升高，并且与不良预后相关，这可能对非常早期的肺癌的诊断和预后有价值。证明血浆microRNA特征分类器具有预测，诊断和预后价值，并且MSC可以通过降低假阳性率来补充LDCT筛查。研究人员验证了血清microRNA签名，可以作为高风险人群进行肺癌筛查的有用工具。其他人描述了一种称为癌症SEEK的多分析物血液测试，它可以通过对循环蛋白水平和驱动基因突变的综合评估来检测相对早期癌症的存在并定位癌症的起源器官。在本文中，外泌体是肺癌中理想的生物标志物，除了它们在大多数体液中的可及性和稳定性外，还反映了亲本细胞的特征，如下所述。
　　 外泌体作为抗癌药物的载体
　　 新出现的证据表明，外泌体是一种有前途的药物输送系统，因为外泌体具有独特的特征，例如，免疫原性低，毒性降低，生物相容性高以及超越生物屏障，纳米级尺寸和靶标归巢特异性。专家报道了一种新型的纳米颗粒药物递送系统，外泌体-姜黄素复合物，并显示外泌体可以增加姜黄素的溶解度，稳定性和生物利用度，从而增强姜黄素的抗炎活性。还有人证明微囊泡相关腺病毒载体作为一种新型基因传递系统可以增强培养细胞中的基因转移。评估表明，MVs可以作为细胞来源的基因传递载体，将治疗性的mRNA/蛋白质转移至靶肿瘤细胞，从而通过在受体细胞中表达高水平的功能蛋白来抑制神经鞘瘤的生长。员工通过使用在体外和体内均显示出高度抗肿瘤活性的外泌体验证了阿霉素的递送平台。此外，评估了基于外来体的紫杉醇制剂治疗多种耐药癌症的可行性。结果表明，将PTX掺入外泌体显着增加了耐药细胞中的药物蓄积水平和细胞毒性。此外证明气管给药的外泌体到达了肺转移，并将其药物有效载荷转运到体内靶向癌细胞。开发了一种用于肺癌治疗的基于外泌体的药物递送系统，称为纳米体，该系统由通过加载到外泌体上的pH敏感连接体与抗癌药物阿霉素偶联的GNP组成。在酸性条件下药物释放速率增加，受体细胞成功吸收纳米小体以及细胞活力分析表明，纳米小体对除非癌细胞外的癌细胞均显示出优先的细胞毒性。Celastrol是一种植物来源的三萜类化合物，通过抑制NF-κB活化和细胞周期进程，以及通过诱导慢性内质网应激介导的细胞凋亡，抑制A549和H1299细胞的增殖。与游离的Celastrol相比，将Celastrol封装到牛乳来源的外泌体中显示出更高的抗肿瘤功效并降低了毒副作用。开发了一种基于外泌体的药物递送系统AA-PEG-exoPTX，该系统与紫杉醇结合的巨噬细胞衍生的外泌体结合了氨基乙基茴香酰胺-聚乙二醇载体部分。进一步证明，AA-PEG-exoPTXAA-PEG-exoPTX通过靶向在肺癌细胞中过度表达的sigma受体，有效抑制了肺转移。这些数据支持基于外泌体的药物制剂可以为抗癌治疗提供功能强大且免疫原性低的递送系统，但是，仍然存在一些尚未解决的技术，功能和安全问题，例如在癌细胞中的优先积累，有效运输所装货物进入靶癌细胞并控制药物释放，因此需要更多的研究来揭示这些机制。
　　 总之，外泌体可以影响肺癌的进展，外泌体可能是肺癌治疗的替代选择。尽管如此，仍有一些问题尚待解决。首先，外泌体的大量提取和全面表征仍然具有挑战性，这将影响临床应用，生物医学研究以及生产成本，因此，我们可以结合多种分离技术来优化外泌体的分离和富集。其次，外泌体可以在肺癌细胞及其微环境之间转移生物活性分子，但是，需要阐明外泌体用于将某些货物准确运送到特定目标细胞的机制。第三，外来体是肺癌诊断，预测和预后以及实时监测治疗反应的有前途的生物标志物。但是，这些研究通常发现样本量小且重复性差，因此需要进行大型的多中心研究以提高液体活检的有效性。最后，基于外泌体的临床试验已在肺癌中完成，此外，仍在进行一些临床试验，这些研究可为基于外泌体的治疗药物向临床的过渡提供证据。不久的将来。