胃癌患者对克唑替尼耐药

　　胃癌是世界上最常见的癌症之一，标准化学疗法对转移性或不可切除的GC患者的疗效有限。受体酪氨酸激酶MET的异常激活，以及MET基因突变的扩增和激活，被认为在包括非小细胞肺癌在内的实体恶性肿瘤中引起组成型MET激活，胃食管癌，大肠癌和胶质母细胞瘤。MET基因扩增和突变的患者通常与疾病的晚期阶段和不良的临床结果相关。
　　 MET扩增在1.5-30.5％实测值胃癌症患者，和MET酪氨酸激酶抑制剂已经用含GC的个体中的有吸引力的治疗选择MET扩增和突变。基于MET抑制剂的结合方式和选择性特征，可将其分为不同类型。I型MET抑制剂保留或增强了MET的自抑制构象，并具有高结合效率和高选择性特征。II型MET抑制剂靶向的激酶范围更广，这也与脱靶命中率升高相关。
　　 克里唑替尼是一种原型I型MET抑制剂，具有一U形装订模式在与NSCLC窝藏ALK，ROS1重排或MET扩增。MET-扩增GC显示出很大的灵敏度克里唑替尼二者在体外和体内。Cabozatinib和foretinib是占据了MET的深疏水后袋的多目标II型MET抑制剂。卡博替尼目前正在与durvalumab联合进行的一项I期试验中，用于先前治疗的晚期胃食管癌和其他胃肠道恶性肿瘤的患者。Foretinib已经过I/II期评估，用于治疗晚期实体瘤，包括NSCLC和GC。MET靶向治疗的其他研究报告说，福瑞替尼可以在GC的临床前模型中增强化疗反应。
　　 由于MET信号传导途径的复杂性及其与其他致癌途径的广泛串扰，对MET抑制剂的耐药性不可避免地发展并导致临床复发。在克唑替尼治疗下，有肿瘤进展的患者报道了许多次级位点MET突变，例如METD1228N/H/V，D1231Y和Y1230H。先前，我们还报道了对克唑替尼产生抗药性后，IV期GC患者发生了多个继发性MET突变。基于MET和克唑替尼的共晶体结构，我们选择了四个新的耐克唑替尼耐药性突变V1092L，G1163R，D1228G和D1228Y，以评估它们对II型TKI疗效的影响，并为患有克唑替尼耐药性MET突变的GC患者提供更好的治疗选择。
　　 293T和Ba/F3细胞获自美国典型培养物保藏中心。293T细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基中培养，并补充了10％的胎牛血清和1％的链霉素和青霉素公司。Ba/F3及其衍生物在补充有10％FBS，链霉素和青霉素和10ng/mlIL3的RPMI1640中保存。将细胞在37℃，湿润的气氛和5％CO2中培养。
　　 通过DNA测序确认所有构建体。pBABE-puro购自Addgene。将易位启动子区-MET融合序列克隆到pBABE-puro逆转录病毒载体中，该载体在鼠干细胞病毒启动子的控制下。使用QuikChangeIIXL定点诱变试剂盒引入MET突变。
　　 对于瞬时过表达MET，DNA的4微克转染到1×106使用的FuGENE293T细胞6转染试剂在Opti-MEM介质中。转染后24小时，用血清饥饿的培养基代替培养基。用各种浓度的抑制剂处理细胞2小时。
　　 对于反转录病毒转导，293T细胞用pBABE-PURO构建体中使用所述的FuGENE的ECOPACK包装质粒转染的组合转染试剂中，根据制造商的方案。转染后48小时收获病毒上清液，过滤，与10μg/ml聚丙烯一起添加到Ba/F3中，并以1000rpm离心5分钟。Ba/F3用含有TPR-MET的慢病毒感染，并在2代中用2μg/ml的嘌呤霉素选择MET突变体，以稳定地表达指定的蛋白质。
　　 将总共1×104Ba/F3细胞接种在96孔板的每个孔中，并用指定浓度的crizotinib，cabozantinib或foretinib处理72次H。二甲基亚砜用作载体对照。按照制造商的说明，使用AlamarBlueTest测量细胞存活率。相对细胞存活率相对于媒介物对照标准化。所有实验重复三遍。
　　 用0、0.05、0.1、0.3μM的每种抑制剂处理TPR-MET293T衍生物2h，然后通过蛋白质印迹法进行分析。通过在含有NaCl，NP40，脱氧胆酸钠，SDS的RIPA缓冲液中裂解蛋白质来从全细胞中提取蛋白质。和EDTA补充有蛋白酶PMSF和1xHalt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。使用Bradford蛋白质检测试剂盒测定澄清的裂解物的蛋白质浓度。每个样品中总共20和40μg的蛋白质分别进行总蛋白的Westernblotting和磷酸化蛋白检测，并使用特异性抗体进行探测。洗涤并与HRP二级抗体孵育后，使用ECL检测试剂观察条带。
　　 为了确认获得的针对I型METTKI克唑替尼的MET突变介导的耐药性，我们产生了TPR-MET融合蛋白。TPR，包括来自染色体1q25的exon1，它编码二聚化亮氨酸拉链基序，该基序允许激酶的组成性和配体依赖性激活，以及MET酪氨酸激酶结构域，包括外显子13-21，其中包含激酶的结构域和羧基末端来自染色体7q31的Met受体酪氨酸激酶均从cDNA扩增。使用GM18535mRNA分别与TPR-F/R和MET-F/R引物进行逆转录。将两个PCR产物通过重叠延伸PCR使用TPR-F和MET-R引物加入。将携带V1092L，G1163R，D1228Y/G突变的TPR-MET转染到Ba/F3细胞中。野生型用作阴性对照，而D1228N和Y1230H是克唑替尼耐药的阳性对照。一旦表达了TPR-MET融合蛋白及其衍生突变，得到的Ba/F3TPR-MET细胞的存活就不再依赖IL3。蛋白质印迹结果也验证了TPR-MET蛋白在Ba/F3细胞中的表达。
　　 用浓度增加的TKIs处理72小时后评估细胞增殖。与临床观察一致，携带突变体的Ba/F3细胞均对克唑替尼具有抗药性。为了比较IC50年代不同的基团之间，所有IC50年代在突变体相同的TKI治疗内与WT比较，并报道为倍数变化。G1163R和D1228Y突变使IC50分别增加了43.5倍和47.1倍。V1092L和D1228G突变的crizotinibIC50降低幅度分别为4倍和13倍。四个突变体对II型TKI，cabozantinib和foretinib表现出不同的敏感性。与D1228G和Y1230H相比，V1092L突变体对Cabozantinib和Foretinib的敏感性分别高21和9.5倍，而G1163R，D1228Y和D1228N突变体的IC50增加。总的来说，我们发现V1092L和D1228G对I型METTKI具有抵抗力，但对II型METTKI敏感，而G1163R和D1228Y对这两种类型的TKI均具有抵抗力。
　　 作为MET激酶的下游途径，PI3K/AKT，MAPK/ERK和JAK2/STAT3信号在MET信号激活中起关键作用。为了评估MET突变体的生化抑制作用，我们检查了用不同TKI处理的Ba/F3细胞中MET信号通路的磷酸化。与细胞生存力测定的结果一致，克唑替尼治疗并未抑制所有突变体中的MEK1/2，ERK2，AKT，STAT3磷酸化。V1092L表现出对MET自磷酸化的强烈抑制，但在下游信号中没有。D1228Y和Y1230H的MET自磷酸化趋势下降;但是，下游信号也不受影响。
　　 经卡博替尼处理后，与WT相似，在V1092突变体中MET，MEK1/2，ERK1/2的磷酸化受到强烈抑制。在G1163R，D1228G/Y/N，Y1230H突变体中也观察到了磷酸化MET，MEK1/2，ERK1/2的抑制作用，尽管其水平远低于V1092L突变体。有趣的是，卡博替尼在野生型和突变体中均不能抑制AKT和STAT3的磷酸化，这表明卡博替尼对MET的抑制作用可能不会通过PI3K/AKT和JAK/STAT3途径进行。与卡博替尼相比，福雷替尼对WT和突变基团的MET，MEK1/2和ERK1/2磷酸化具有更强的抑制作用。与野生型相似，用高浓度的替尼替尼治疗后，G1163R中的AKT和STAT3磷酸化也降低了。
　　 克唑替尼占据了MET的ATP结合口袋，并通过氢键和疏水相互作用连接相邻的氨基酸。ATP结合口袋内的突变可能会破坏克唑替尼的结合并随后导致耐药性。另一方面，foretinib的结合远离ATP结合位点，这可以解释MET突变体对I型和II型TKI的不同反应。
　　 我们用两个METTKI对METWT和突变体进行了重塑，以分析由不同突变引起的构象变化。药物结合袋顶部的V1092L突变改变了后侧链并阻止了克唑替尼的合并。结合袋边缘的G1163R突变增加了对克唑替尼和foretinib的空间位阻。氨基酸D1228与位点1110形成一个盐桥，并参与结合口袋的展开。该位点的D1228G/N突变导致盐桥的丢失和结合口袋的重新定位。因此，会损害克唑替尼的结合。我们的配体结合研究结果与细胞增殖和Westernblot分析结果一致。
　　 克唑替尼在治疗MET扩增的癌症方面已显示出令人鼓舞的效果；然而，克唑替尼的疗效因MET的二次突变而受损，已成为一个反复出现的临床问题。为了获得更好的临床结果，在使用MET抑制剂治疗之前和期间，必须仔细监测癌症患者MET激酶域中的氨基酸取代。在肺癌中，获得性的MET突变D1228V诱导了对I型METTKI的抗性，同时保持了对II型METTKI的敏感性。基于这些发现，一名患者接受厄洛替尼联合卡博替尼治疗，并显示出反应。在另一种具有I型MET抑制剂抗性突变的情况下，METD1228N/V和Y1230H，患者接受卡博替尼和奥西替尼的联合治疗，可显着缓解患者的症状，并导致METD1228H，Y1230H和D1231Y突变消失。在另一个例子中，据报道在具有克唑替尼症状进展的患者中METG1108C突变。该患者患有严重的肺炎和感染，最终死亡。在METY1230C突变也被确定为在NSCLC患者，然后升温至下面的克里唑替尼治疗13个月的电阻机构的预先存在的低级别的突变，并导致疾病进展。因此，潜在的METTKI抗药性突变的复杂性和多样性凸显了对连续监测接受靶向治疗的患者的需求。
　　 在先前的病例报告中，我们在克唑替尼治疗后不久复发肿瘤的GC患者中观察到D1228G/H/N/V/Y，G1163Y，L1195V，Y1230C/H/N和V1092L突变。除了对克唑替尼具有耐药性的突变研究之外，我们还使用结构分析重点研究了四个新突变，包括V1092L，G1163R和D1228G/Y。与以前的临床数据一致，我们证实了该突变使用Ba/F3细胞模型中的细胞生存力分析和MET信号传导途径的分析赋予了对克唑替尼耐药性。具体而言，V1092L突变对II型TKI治疗高度敏感，而G1163R赋予了最大的抵抗力。从蛋白质印迹分析，我们观察到II型TKI，cabozantinib和foretinib对PI3K-AKT信号传导和STAT3信号传导通路的抑制作用较小。但是，那些II型TKI在WT和突变细胞中提供了对MEK/ERK信号通路的强烈抑制作用。
　　 总之，我们发现METG1163R和D1228Y突变均对I型和II型METTKI具有抗性，而V1092L和D1228G突变对I型METTKI具有抗性并对II型METTKI敏感。结构建模还支持了突变对不同TKI反应的影响。因此，这项研究表明，第二代MET-TKIs可用于治疗携带V1092L和D1228G突变的GC患者，但不能用于治疗获得克唑替尼耐药性后携带G1163R和D1228Y突变的GC患者。