这种方法的基本原理与前一种方法一致。在这种情况下，通过抑制涉及维持不受限制的细胞增殖和获得转移表型的基因的功能来尝试校正正和负增殖信号之间的不平衡。上文提到的许多缺点可以在这里应用，例如需要高效的基因转移方法和靶基因在恶性转化中的主导作用。随着基因组和蛋白质组水平的癌症知识的进步，候选癌基因的数量不断增加。希望抑制癌基因表达不仅会降低细胞增殖，还会恢复细胞对细胞凋亡刺激的敏感性。例如，众所周知，除了阻断一系列有丝分裂信号外，Ras癌基因的抑制减轻了对p53途径的抑制作用，并使细胞易于凋亡。这可能是其他癌基因如垂体肿瘤转化基因1（PTTG1）的情况。
　　另一个例子是端粒酶的催化亚基（端粒酶逆转录酶，TERT）。由于端粒酶功能对于维持每个细胞分裂中的端粒长度是必需的，因此经历不受限制的细胞增殖的癌细胞呈现TERT表达的激活。因此，当端粒重复最终耗尽时，假设抑制TERT在几次分裂后引起细胞生长的抑制。然而，有效抑制端粒酶表达能够在几天内诱导细胞凋亡，这与其调节蛋白延长功能无关。新数据表明端粒酶也是保护染色体末端不被识别为DNA中断所必需的，这会引发细胞凋亡。不同的方法用于抑制癌基因的表达。其中之一是基于反义核苷酸的转移，人工序列与对应于试图抑制的基因的mRNA互补。这些可以是短序列（反义寡核苷酸，ASO）或完整cDNA。几种机制解释了基因表达的阻断，最广泛传播和研究的是细胞核酸酶如RNA酶H对RNA-DNA杂交体的降解。最近的一种方法是RNA干扰，另一种基于生产的转录后基因沉默机制与靶mRNA互补的双链RNA片段。使用内源细胞机制，将双链RNA加工成21至23个核苷酸的短干扰RNA（siRNA），其识别同源mRNA并触发其降解。或者，可以直接转染siRNA。在“三螺旋”策略中，抑制性寡核苷酸（三链形成寡核苷酸，TFO）靶向细胞双链DNA。它们与基因组DNA的次要或主要树丛中的多嘌呤-多嘧啶序列相互作用，并根据互补序列的定位阻断不同水平的基因表达。它们不仅可能用于基因表达修饰，还可用于基因校正策略。最后，分泌的或胞内的基于抗体的分子的表达已经提出来阻止癌基因。在HCC的情况下，几种基因的抑制显示出潜在的抗肿瘤作用。大多数报道提供了在细胞培养中使用HCC衍生细胞系显示生长抑制或诱导细胞凋亡的概念证据。在体内在动物模型中进行的研究显示肿瘤生长迟缓，尤其是当癌细胞被转染的离体，但是，当完全根除难以在体内基因治疗是在预先存在的肿瘤中进行测试。
　　由于端粒酶和Wnt途径激活经常与HCC相关的，不同的方法包括反义分子和siRNA已被用来抑制他们。反义技术也用于抗FGF-2，VEGF和COX-2基因。三链螺旋方法显示与HCC细胞中抑制IGF-I和诱导细胞凋亡的反义技术相似的结果。当将细胞注射到小鼠中时，观察到免疫介导的抗肿瘤保护作用。PTTG1的抑制和尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）已经在HCC细胞。发现诱导过度磷酸化并增加pRB降解的p28-GANK癌蛋白在大多数HCC中过表达。重复施用诱导产生针对p28-GANK的siRNA的腺病毒载体导致人HCC异种移植物在裸鼠中的生长显着降低。这表明癌基因的连续抑制可能对肿瘤的进展具有强烈影响。该方法的临床应用具有挑战性，因为需要高效的长期表达载体而不是第一代腺病毒。这种方法基于外源基因的转移，该基因将无毒的前药转化为癌细胞中的细胞毒性代谢物。一旦全身给予前药，表达转化酶的转导细胞死亡，并且在某些情况下，引起周围细胞的破坏（旁观者效应）。与其他基因治疗策略不同，GDEPT缺乏内在的肿瘤特异性，并依赖于细胞转移水平的肿瘤靶向（取决于载体和给药途径）和基因表达（取决于肿瘤特异性启动子）。GDEPT系统的功效受旁观者效应程度的影响很大，因为当前基因治疗载体中肿瘤细胞的分数通常较低。来自HSV-1（HSV-TK）的胸苷激酶基因与前药更昔洛韦（GCV）联合使用是最早且最常用的GDEPT系统应用于肝癌晚期和其他癌症。它在相关的肝癌晚期动物模型中显示出显着的抗肿瘤作用，如致癌物诱导的大鼠HCC。HSV-TK将更昔洛韦转化为单磷酸中间体，随后通过细胞酶转化为三磷酸盐形式。这是一种高极性分子，不能扩散到细胞外。通过有毒代谢物的间隙连接转移和邻近细胞的吞噬作用解释了该系统的旁观者效应，但与其他GDEPT模式相比，这种局部效应较弱。TK与VP22蛋白的融合可以通过将酶转移到周围细胞来扩增效果。更昔洛韦三磷酸掺入到DNA，并导致细胞凋亡的细胞周期依赖性的方式，但它可以在正常肝细胞引起线粒体毒性如果HSV-TK的表达不限于HCC细胞。除治疗目的外，HSV-TK可被认为是PET分析的报告基因。它已成功用于可视化人类腺病毒载体对HCC的转导。到目前为止，在不同的HCC动物模型中观察到的HSV-TK系统的良好抗肿瘤效果尚未在临床环境中得到证实。上其他癌症进行临床和临床前研究表明，HSV-TK可以作为在建立针对肿瘤。然而，需要与其他疗法相结合。在临床前研究中，辐射诱导的Egr-1启动子用于控制HSV-TK与放射性同位素（I131lipiodol）联合的表达。因此，HSV-TK的表达受到内部辐射的刺激，两种治疗的抗肿瘤作用是协同的。酵母胞嘧啶脱氨酶将抗真菌药物5-氟胞嘧啶（5-FC）转化为细胞毒性胸苷酸合成酶抑制剂5-氟尿嘧啶（5-FU）。这种代谢物可以局部扩散并引起比磷酸化更昔洛韦更广泛的旁观者效应，但细胞毒性也是细胞周期依赖性的。该系统已在具有良好的效果。5-FU对肝癌晚期患者的疗效非常低，但这种策略可以实现高局部浓度的药物。在这种情况下，应仔细评估正常肝脏的毒性。此外，习惯性肠杆菌中存在胞嘧啶脱氨酶将5-FC转化为5-FU可能导致毒性。
　　 其他GDEPT方法产生非常有效的DNA交联剂，其效果主要与细胞周期无关。这些包括细胞色素P450/环磷酰胺和硝基还原酶/二硝基苯甲酰胺CB系统。报道了在肝癌晚期患者中肿瘤内施用表达硝基还原酶的第一代腺病毒载体是安全可行的。转基因表达是剂量依赖性的并且应该是临床相关的，尽管在该研究中没有向患者施用前药。观察到针对载体和治疗基因的强免疫应答，表明再次施用治疗可能不是有益的。在接受前药的患者中评估该方法的抗肿瘤作用和毒性需要新的临床试验。